Скрининг более мелких органических соединений, называемых фрагментами, с использованием рентгеновской кристаллографии является эффективным методом идентификации молекул, которые являются отправными точками для открытия лекарств или разработки биохимических соединений. Скрининг кристаллографических фрагментов выявил не только идентичность, но и где и как фрагменты связываются на поверхности исследуемого белка. Этот метод может быть использован на каждой биохимической или медицинской значимой белковой мишени, для которой могут быть выращены подходящие кристаллы белка.
Качество результатов тесно связано с качеством обработки образцов. Мы считаем, что следующая визуальная демонстрация поможет исследователям провести высококачественные эксперименты. Продемонстрировать процедуру будет Татьяна Бартель, докторант и аспирант в моей лаборатории.
Для начала отрежьте мешок просеиваемой пластины, предварительно нагретой до комнатной температуры, затем снимите крышку и фольгу с просеиваемой пластины. Замачить пятимиллилитровой раствор для замачивания в резервуар реагента. Затем заполните каждый из 96 резервуаров пластины 40 микролитрами раствора для замачивания с помощью 12-канальной пипетки.
Поместите рамку легкого доступа поверх экранной пластины и закрепите ее прилагаемыми зажимами, сдвинув их на левую и правую стороны устройства. Поместите просеивательную пластину и рамку с легким доступом под микроскоп и скольжьте первый колодец, переместив соответствующую плитку из акрилового стекла рамы. Добавьте 0,4 микролитра раствора для замачивания из резервуара к фрагменту, содержащему хорошо, используя свежий наконечник пипетки.
Убедитесь, что капля покрывает высохший фрагмент. Поместите кристаллизационную пластину, содержащую самые крупные кристаллы, под второй микроскоп и разрежьте уплотнительную фольгу в одной из скважин. Используя петлю соответствующего размера, перенесите кристалл в колодец просеивающего листа под первым микроскопом.
Вымойте петлю в подготовленной стеклянной точечной пластине, затем высушите ее, осторожно прикоснувшись к ткани. Делайте это после каждой переноски, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Используйте микроскоп, чтобы убедиться, что кристалл был правильно размещен.
Повторите процедуру для второго кристалла. Переходите к следующей скважине и повторяйте процедуру для всех оставшихся скважин. После того, как кристаллы были перенесены во все 96 скважин в просеивающей пластине, снимите просеиваемую пластину вместе с рамкой легкодоступного доступа из-под микроскопа и поместите ее на скамейку или стол.
Затем снимите рамку легкого доступа с просеивающей пластины, запечатайте просеивающую пластину уплотнительной пленкой и поместите ее в кристаллизационный инкубатор или шкаф для инкубации для ранее оптимизированного времени замачивания. Достаточно двух часов инкубации, но ночь может быть удобнее. Приготовьте пену Unipuck Dewar с тремя крышками Unipuck и наполовину заполните ее жидким азотом, держа на земле.
Переместите наполовину заполненного Дьюара на скамейку запасных, и заполните ее полностью до самого края. Держите его заполненным до верхнего края в течение всего эксперимента и часто заменяйте жидкий азот. Извлеките просеивательную пластину из инкубатора и снимите фольгу.
Поместите рамку легкого доступа сверху. Сдвиньте первый колодец. Извлеките один кристалл из капли и охладите его в жидком азоте, погружаясь быстрым вертикальным движением.
Вставьте образец в правильное положение шайбы и сделайте соответствующие заметки на листе отслеживания образца. Повторите процедуру для второго кристалла. Подойдите к следующему колодец и повторяйте позиционирование других кристаллов до тех пор, пока все три шайбы не будут заполнены.
Предварительно охладите основания Unipuck жидким азотом и добавьте их поверх крышек. Храните Унипуков в стеллаже для хранения в транспорте Дьюара или хранилище Дьюара. Храните их в жидком азоте при криогенных температурах до измерения.
Повторите ту же процедуру сбора и хранения кристаллов в Unipucks для оставшихся образцов в просеивающей пластине. Здесь показана изменчивость кристаллической морфологии после выполнения замачивания фрагментов и сбора кристаллов. Были включены даже кристаллы, которые выглядят несколько испорченными, поскольку они все еще приводят к полезным данным.
Данные были собраны на линиях луча 14.1 и 14.2 на синхротроне BESSY II. Для каждого образца осуществлялся сбор дифракционных данных. Данные были проанализированы с использованием FragMAXapp, сосредоточив внимание на комбинации XDSAPP для обработки, fspipeline для уточнения структуры и PenDA для поиска попаданий.
Это привело к 15 ударам по белковым комплексу AR с использованием условия свободного замачивания DMSO. В предыдущей кампании экрана входа F2X против той же цели, включая DMSO в состоянии впитывания, было обнаружено 20 попаданий. Это означает, что 75% обращений могут быть идентифицированы, если DMSO опущен.
Для успеха эксперимента крайне важно, чтобы кристаллы обрабатывались правильно и осторожно на каждом этапе процедуры. Скрининг кристаллографических фрагментов превратился в широко используемый метод, который часто применяется в академических кругах и в фармацевтической промышленности.
