Das Screening kleinerer organischer Verbindungen, sogenannter Fragmente, mittels Röntgenkristallographie ist eine effiziente Methode zur Identifizierung von Molekülen, die Ausgangspunkte für die Wirkstoffforschung oder die Entwicklung biochemischer Werkzeugverbindungen sind. Das kristallographische Fragmentscreening ergab nicht nur die Identität, sondern auch, wo und wie sich die Fragmente auf der Oberfläche des untersuchten Proteins binden. Diese Technik kann auf jedem biochemisch oder medizinisch relevanten Proteinziel angewendet werden, für das geeignete Proteinkristalle gezüchtet werden können.
Die Qualität der Ergebnisse ist eng mit der Qualität der Probenhandhabung verbunden. Wir glauben, dass die folgende visuelle Demonstration den Forschern helfen wird, qualitativ hochwertige Experimente durchzuführen. Demonstriert wird das Verfahren von Tatjana Barthel, Doktorandin und Doktorandin in meinem Labor.
Schneiden Sie zunächst den auf Raumtemperatur vorgewärmten Beutel der Siebplatte auf und entfernen Sie dann den Deckel und die Folie von der Siebplatte. Dekantieren Sie die fünf Milliliter einweichende Lösung im Reagenzbehälter. Füllen Sie dann jeden der 96 Behälter der Platte mit 40 Mikrolitern Einweichlösung mit einer 12-Kanal-Pipette.
Legen Sie den leicht zugänglichen Rahmen auf die Siebplatte und befestigen Sie ihn mit den mitgelieferten Klemmen, indem Sie sie auf die linke und rechte Seite des Geräts schieben. Legen Sie die Siebplatte und den leicht zugänglichen Rahmen unter das Mikroskop und schieben Sie den ersten Brunnen auf, indem Sie die jeweilige Acrylglasfliese des Rahmens bewegen. 0,4 Mikroliter Einweichlösung aus dem Reservoir mit einer frischen Pipettenspitze in das Fragment geben, das den Brunnen enthält.
Stellen Sie sicher, dass der Tropfen das getrocknete Fragment bedeckt. Legen Sie die Kristallisationsplatte, die die größten Kristalle enthält, unter das zweite Mikroskop und schneiden Sie die Siegelfolie an einem der Vertiefungen auf. Übertragen Sie mit einer entsprechend großen Schlaufe einen Kristall unter dem ersten Mikroskop auf den Brunnen der Siebplatte.
Waschen Sie die Schlaufe in der vorbereiteten Glasfleckplatte und trocknen Sie sie dann ab, indem Sie sie vorsichtig mit dem Gewebe berühren. Tun Sie dies nach jedem Transfer, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Verwenden Sie das Mikroskop, um sicherzustellen, dass der Kristall richtig platziert wurde.
Wiederholen Sie den Vorgang für den zweiten Kristall. Fahren Sie mit der nächsten Bohrung fort und wiederholen Sie den Vorgang für alle verbleibenden Brunnen. Nachdem die Kristalle auf alle 96 Vertiefungen in der Siebplatte übertragen wurden, entfernen Sie die Siebplatte zusammen mit dem leicht zugänglichen Rahmen unter dem Mikroskop und legen Sie sie auf die Bank oder den Tisch.
Entfernen Sie dann den leicht zugänglichen Rahmen von der Siebplatte, versiegeln Sie die Siebplatte mit Siegelfolie und legen Sie sie in den Kristallisationsinkubator oder Schrank, um sie für die zuvor optimierte Einweichzeit zu inkubieren. Zwei Stunden Inkubation sind ausreichend, aber über Nacht kann bequemer sein. Bereiten Sie den Unipuck-Schaum Dewar mit drei Unipuck-Deckeln vor und füllen Sie ihn zur Hälfte mit flüssigem Stickstoff, um ihn auf dem Boden zu halten.
Bewegen Sie den halbgefüllten Dewar auf die Bank und füllen Sie ihn vollständig bis zum Rand. Halten Sie es während des gesamten Experiments bis zum oberen Rand gefüllt und ersetzen Sie den flüssigen Stickstoff häufig. Holen Sie die Siebplatte aus dem Inkubator und entfernen Sie die Folie.
Platzieren Sie den leicht zugänglichen Rahmen oben. Öffnen Sie den ersten Brunnen. Ernten Sie einen Kristall aus dem Tropfen und kühlen Sie ihn in flüssigem Stickstoff ab, indem Sie ihn mit einer schnellen vertikalen Bewegung eintauchen.
Legen Sie die Probe in die richtige Puckposition ein und machen Sie relevante Notizen auf dem Probenverfolgungsblatt. Wiederholen Sie den Vorgang für den zweiten Kristall. Gehen Sie zum nächsten Brunnen und wiederholen Sie die Positionierung anderer Kristalle, bis alle drei Pucks voll sind.
Kühlen Sie die Unipuck-Basen in flüssigem Stickstoff vor und fügen Sie sie auf die Deckel hinzu. Lagern Sie die Unipucks im Lagerregal in einem Transport-Dewar oder Lager-Dewar. Bewahren Sie sie bis zur Messung in flüssigem Stickstoff bei kryogenen Temperaturen auf.
Wiederholen Sie den gleichen Vorgang der Ernte und Lagerung der Kristalle in Unipucks für die verbleibenden Proben in der Siebplatte. Die Variabilität der Kristallmorphologien nach Durchführung der Fragmenteinweichung und Kristallernte wird hier gezeigt. Sogar Kristalle, die etwas verschlechtert aussehen, wurden aufgenommen, da sie immer noch zu nützlichen Daten führen.
Die Daten wurden an den Beamlines 14.1 und 14.2 am Synchrotron BESSY II gesammelt. Für jede Probe wurde eine Beugungsdatenerfassung durchgeführt. Die Daten wurden mit FragMAXapp analysiert, wobei der Schwerpunkt auf der Kombination von XDSAPP für die Verarbeitung, fspipeline für die Strukturverfeinerung und PenDA für die Treffersuche lag.
Dies führte zu 15 Treffern auf den AR-Proteinkomplex unter Verwendung einer DMSO-freien Einweichbedingung. In einer früheren Kampagne des F2X-Einstiegsbildschirms gegen das gleiche Ziel, einschließlich DMSO im durchnässten Zustand, wurden 20 Treffer gefunden. Das bedeutet, dass 75% der Treffer identifiziert werden können, wenn DMSO weggelassen wird.
Für den Erfolg des Experiments ist es entscheidend, dass die Kristalle bei jedem Schritt des Eingriffs richtig und sorgfältig behandelt werden. Das kristallographische Fragmentscreening hat sich zu einer weit verbreiteten Technik entwickelt, die häufig in der Wissenschaft und in der pharmazeutischen Industrie angewendet wird.
