ヘルムホルツ・ツェントルムベルリンにおける結晶学的フラグメントスクリーニングのワークフローとツール

X線結晶学を用いた断片と呼ばれる小さな有機化合物のスクリーニングは、創薬や生化学的ツール化合物開発の出発点である分子を同定するための効率的な方法です。結晶学的断片スクリーニングは、同一性だけでなく、研究中のタンパク質の表面上で断片が結合する場所と方法も明らかにした。この技術は、適切なタンパク質結晶を成長させることができるすべての生化学的または医学的に関連するタンパク質標的に使用することができる。

結果の品質は、サンプル処理の品質に密接に関連しています。以下の目視デモンストレーションは、研究者が高品質な実験を行う上で役立つと考えています。この手順を実証することは、私の研究室の博士研究員で博士課程の学生であるタジャナ・バルテルです。

まず、スクリーニングプレートの袋を室温に予め温め開き、ふたとホイルをスクリーニングプレートから取り除きます。試薬貯留槽に5ミリリットルの浸漬液をデカントする。その後、12チャネルピペットを使用して、プレートの96リザーバーのそれぞれに40マイクロリットルの浸漬溶液を充填します。

スクリーニングプレートの上に簡単にアクセスできるフレームを置き、デバイスの左右にスライドさせて、付属のクランプで固定します。顕微鏡下にスクリーニングプレートと簡単にアクセスフレームを配置し、フレームのそれぞれのアクリルガラスタイルを移動させることによって最初のウェルをスライド開きます。新鮮なピペットチップを使用して、貯水池からよく含まれる断片に浸漬溶液の0.4マイクロリットルを追加します。

ドロップが乾燥したフラグメントを覆っていることを確認します。2番目の顕微鏡の下に最大の結晶を含む結晶板を置き、ウェルの1つでシールホイルを切り開きます。適当なサイズのループを使用して、第1の顕微鏡下でスクリーニングプレートのウェルに結晶を移す。

準備したガラススポットプレートでループを洗い、組織にそっと触れて乾燥させます。クロスコンタミネーションを避けるために、すべての転送後にこれを行います。顕微鏡を使用して、クリスタルが適切に配置されていることを確認します。

2番目の結晶に対して手順を繰り返します。次の井戸に移動し、残りのすべての井戸の手順を繰り返します。結晶がスクリーニングプレート内の96のウェルすべてに移された後、顕微鏡下から簡単にアクセスできるフレームと一緒にスクリーニングプレートを取り外し、ベンチまたはテーブルに置きます。

次に、スクリーニングプレートから容易にアクセスできるフレームを取り出し、スクリーニングプレートをシールホイルで密封し、結晶化インキュベーターまたは食器棚に入れて、以前に最適化された浸漬時間のためにインキュベートします。2時間のインキュベーションで十分ですが、一晩がより便利かもしれません。3つのユニパック蓋でユニパックフォームデュワーを準備し、半分は地面にそれを維持し、液体窒素でそれを埋めます。

半分満たされたデュワーをベンチに移動し、それを完全に端まで埋めます。実験全体の間、上端まで充填し、液体窒素を頻繁に交換してください。インキュベーターからスクリーニングプレートを取り出し、ホイルを取り外します。

簡単なアクセスフレームを上に配置します。最初の井戸をスライドして開きます。落下から1つの結晶を収穫し、フラッシュは速い垂直運動で突っ込むことによって液体窒素でそれを冷却します。

適切なパック位置にサンプルを挿入し、サンプル追跡シートに関連するメモを取ります。2番目の結晶に対して手順を繰り返します。次の井戸に移動し、すべての3パックがいっぱいになるまで、他の結晶の位置を繰り返します。

液体窒素でユニパックベースを事前に冷却し、蓋の上に追加します。ユニパックは、輸送デュワーまたはストレージデュワーのストレージラックに保管してください。測定まで極低温で液体窒素に保管してください。

スクリーニングプレートの残りのサンプルについて、結晶を収穫してUnipucksに保存するのと同じ手順を繰り返します。フラグメント浸漬と結晶採取を行った後の結晶形態の変動をここに示す。やや劣化しているように見える結晶でさえ、有用なデータをもたらすため含まれていました。

データは、ビームライン14.1および14.2でBESSY IIシンクロトロンで収集した。回折データ収集は、各サンプルについて行った。データは、処理のためのXDSAPP、構造改良のためのfspipeline、ヒット発見のためのPenDAの組み合わせに焦点を当てて、FragMAXappを使用して分析されました。

DMSOフリー浸漬条件を用いてARタンパク質複合体に15ヒットを記録した。同じターゲットに対するF2X入力画面の以前のキャンペーンでは、浸漬状態でDMSOを含め、20のヒットが見つかりました。つまり、DMSO を省略すると、ヒットの 75% を識別できます。

実験の成功のためには、結晶が手順の各ステップの間に適切かつ慎重に処理されていることが重要です。結晶学的断片スクリーニングは、広く使用されている技術に成熟しており、これはアカデミアや製薬業界でしばしば適用されます。