الأورام الأرومية الدبقية هي أورام الدماغ المدمرة مع صورة الغازية عالية. هذا النظام الثقافة المشتركة يحاكي هجرة خلايا الورم الأرومي الدبقي على الخلايا العصبية لتلخيص واحدة من الطرق الغازية التي لوحظت في المرضى. يتم التحكم بدقة في هندسة وتكوين نموذج الثقافة المشتركة لدينا.
وهو ييسر إعادة إنتاج أفضل وأيضا تحديد كمي مباشر للعمليات البيولوجية المعقدة. يمكن تكييف هذه الطريقة مع التشخيص السريري من خلال المشاركة في زراعة خلايا الورم الأرومي الدبقي والخلايا العصبية المفككة حديثا. وهو يحدد مؤشر السريرية، وهو أمر مهم جدا كنتيجة سريرية.
يمكن استخدام طريقتنا أيضا لتحديد الخلايا المهاجرة الأخرى، مثل الخلايا الليفية أو الخلايا المناعية. إثبات الإجراء سيكون (جوريس غايون)، طالب دكتوراه من فريقي. لجعل الركيزة لmicropatterning، علاج 18 ملليمتر يغطي الزجاج الدائري عن طريق الهواء أو تنشيط البلازما لمدة خمس دقائق قبل وضع الأغطية في مجفف مع 100 ميكرولتر من triethoxysilane لمدة ساعة واحدة، ثم احتضان حل PEG-SVA في 100 ملليغرام لكل ملليلتر لمدة ساعة واحدة.
لترسب هلام، في نهاية الحضانة، إضافة ثلاثة ميكرولترات من PLPP و 50 ميكرولتر من الإيثانول المطلق على وسط الشريحة والانتظار حتى يجف تماما. بالنسبة للشرائح الزجاجية الصغيرة ، قم بتركيب الغطاء في غرفة Ludin ووضع الغرفة على خشبة مسرح المجهر المجهز بنظام التركيز التلقائي. بعد التصوير، قم بتحميل صور الميكروباترن في البرنامج.
بعد تسلسل الإضاءة التلقائي للأشعة فوق البنفسجية ، استخدم ماصة لغسل PLPP من الغطاء على نطاق واسع مع PBS. ثم احتضان غطاء مع 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من اللامينين لمدة 30 دقيقة، تليها غسل آخر مع برنامج تلفزيوني كما هو موضح. لإعداد ثقافة الخلايا العصبية فرس النهر الفئران الجنينية على الأغطية micropattern، بعد غسل الماضي، ترطيب الشرائح الزجاجية مع الخلايا العصبية ثقافة المتوسطة.
البذور خمس مرات 10 إلى الخلايا العصبية فرس النهر الفئران الرابعة علقت في المتوسط العصبي المخصب مع 3٪ مصل الحصان لكل سنتيمتر مربع على كل غطاء micropatterned لاحتضان 24 ساعة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪ في 37 درجة مئوية. فصل الطرد المركزي خلايا الورم الأرومي الدبقي لمدة خمس دقائق في 1000 دورة في الدقيقة وإعادة إنفاق بيليه في المتوسطة ثقافة الخلايا الأرومية، ثم إيداع مرة واحدة 10 إلى خلايا GBM الثالثة على الخلايا العصبية micropatterned. لتصوير الخلايا الحية للخلايا، ضع الثقافة المشتركة على خشبة مسرح المجهر المقلوب المجهز بغرفة الحرارة 37 درجة مئوية وحدد هدف 20X.
ثم استخدم صندوق أدوات الاستحواذ متعدد الأبعاد في برنامج المجهر للحصول على صور الطماطم الحية Brightfield و epifluorescence GFP كل دقيقتين لمدة 12 ساعة في 16 موقعا مختلفا استنادا إلى عدد الأنماط مع الخلايا العصبية. لتحليل شبكة الخلايا العصبية، بعد التصوير، حدد صورة واحدة من المكدس. انقر بزر الماوس الأيمن على أداة الشبكة لفتح مربع الحوار الخيارات المقابلة وضبط الإعدادات لإنتاج تجزئة دقيقة للصور.
انقر فوق موافق. انقر بزر الماوس الأيسر على أداة الشبكة لتكرار الصورة المحددة وتقسيم الصورة إلى قنوات اللون الأحمر والرمادي والأخضر. حدد القناة الرمادية، وتنفيذ تحسين امتداد التباين لتحسين الفصل بين المناطق المختلفة. استخدم كاشف حافة سوبيل لتنفيذ التواء معالجة الإشارات 2D كما هو مجمع تحت أمر حافة البحث.
للتصفية المزدوجة، قم بتطبيق ضبابية غاوسية ومرشح متوسط لتقليل الضوضاء وتجانس إشارة الكائن. لتحويل إلى قناع تنفيذ خوارزميات عتبة adapted للحصول على صورة ثنائية مع بكسل أبيض وأسود. بعد ذلك ، هيكل عظمي لمنطقة الخلية في شبكة بسيطة واستخدام جزيئات التصفية لإزالة الجسيمات الصغيرة غير الشبكية في النتائج.
جزيئات تصفية الشبكة في صورة شبكة. للحصول على قنوات حمراء وخضراء، قم بإجراء التصفية المزدوجة وتحويلها إلى قناع كما هو موضح باستخدام أسلوب العتبة المكيفة. استخدام تحليل الجسيمات لتحديد مورفولوجيا الخلية في الصورة الخضراء ثنائي.
استخدم أو المشغل لدمج جميع القنوات باستخدام مناطق الاهتمام الخاصة بها وإعادة ضبط لونها الأولي في صورة RGB بسيطة. لإجراء تحليل الحركة أحادي الخلية، انقر بزر الماوس الأيمن على أداة تتبع الخلية الواحدة لفتح مربع الحوار الخيارات المقابلة وضبط الإعدادات لإنتاج تجزئة دقيقة للصور. انقر فوق موافق وانقر بزر الماوس الأيمن على تعقب خلية واحدة لإزالة القناة الرمادية.
لإنشاء صورة مطابقة لمكدس الصور وفقا للوقت، قم بتطبيق إسقاط Z وفلتر مزدوج وتحويل لإخفاء المسارات التي خلفتها الخلايا. إزالة جزيئات صغيرة من الصورة ثنائي الأحمر والأخضر كما هو موضح. استخدم أداة منطقة الاهتمام لتحديد كل محيط من تتبع الخلية والتحقق من مربع الكشف عن حافة التخطي في إطار الحوار خيارات.
عزل القناة الحمراء على المكدس الأصلي وحدد منطقة واحدة من الاهتمام. تصفية مزدوجة كل من الصور وتحويلها إلى قناع للسماح موقف XY سنترويد من كل نواة ثنائية الحجم ليتم تحديدها. يمكن استخدام مواضع XY لحساب متوسط الإزاحة المربعة ونسبة الاتجاه ومتوسط السرعة للخلية.
لتحليل تتبع خلايا متعددة، انقر بزر الماوس الأيمن على أداة التتبع لفتح مربع الحوار الخيارات المقابلة وضبط الإعدادات لإنتاج تجزئة دقيقة للصور. انقر بزر الماوس الأيسر على أداة التتبع لإزالة القناة الرمادية. تقسيم القنوات الحمراء والخضراء، فلتر مزدوج، وتحويل إلى قناع.
ثم استخدم الأمر calculator صورة مع ومشغل لدمج القنوات ترك فقط إشارة النواة الموجودة داخل الأغشية وحساب مؤامرة مسار، يعني الإزاحة مربع، نسبة الاتجاه، ومتوسط سرعة للخلايا كما هو موضح. الفلورسنت GBM شارك مثقف مع الخلايا العصبية منقوشة تعديل شكلها بسرعة وتظهر الهجرة على طول ملحقات الخلايا العصبية في حركة عشوائية. خلايا GBM المصنفة على الخلايا العصبية عرض شكل ممدود مع نتوءات متعددة التي تتبع مسارات الخلايا العصبية في حين أن الخلايا تحتفظ شكلها مدورة عندما مثقف على صفح.
في المراحل اللاحقة من الثقافة ، يمكن ملاحظة نتوءات رقيقة ترتبط بالخلايا في الثقافات المشتركة العصبية GBM. خلايا GBM المصنفة على الخلايا العصبية تثبت قدرة هجرة أكبر من خلايا GBM المصنفة على صفح كما لوحظ في هذه المؤامرات مسار. تحليل التقاء الفلورسنت للخلايا يدل على أنه على مدى فترة مراقبة 500 دقيقة، لوحظ المزيد من هجرة الخلايا عندما يتم زراعة كرويدات مع الخلايا العصبية مما كانت عليه عندما يتم استزراع الخلايا على صفمين وحدها.
في الواقع بحلول نهاية التحليل ، يتم تغطية ما يقرب من نصف النمط بخلايا GBM في حين أن الكرويات المستزرعة على النعناع لا تزال غير مبشرة بالأغطية. اعتمادا على الأسئلة البيولوجية التي تريد الإجابة عليها ، يجب على المرء أن يعتني بأن تصميم النمط وكذلك كثافة الخلية تمثل ظروف الجسم الحي. يمكن إصلاح الخلايا وتصويرها عن طريق المجهر الكونفوجكال.
التصوير الحي ممكن أيضا لأن طريقتنا لا تضعف قدرات التصوير. هذه التقنية مناسبة تماما لدراسة التفاعل الجزيئي، مثل التبادلات الأيضية بين خلايا الورم الأرومي الدبقي والخلايا العصبية. يسمح باستكشاف العمليات البيولوجية وظيفة.
ويمكن أيضا إجراء تجارب عالية الإنتاجية لأغراض سريرية.
