Glioblastomas הם גידולים הרסניים במוח עם פרופיל פולשני גבוה. מערכת תרבות משותפת זו מחקה נדידת תאי גליובלסטומה על נוירונים כדי לכבוש מחדש את אחד המסלולים הפולשניים שנצפו בחולים. הגיאומטריה וההרכב של מודל התרבות המשותפת שלנו נשלטים במדויק.
זה מקל על רבייה טובה יותר וגם כימות פשוט של תהליכים ביולוגיים מורכבים. שיטה זו יכולה להיות מותאמת לאבחון קליני על ידי שיתוף culturing תאים גליובלסטומה מנותקים טריים נוירונים. זה מגדיר מדד קליני, וזה מאוד חשוב כמו תוצאה קלינית.
השיטה שלנו יכולה לשמש גם לכימות תאים נודדים אחרים, כגון פיברובלסטים או תאים חיסוניים. מי שתדגים את ההליך תהיה ג'וריס גיאון, דוקטורנטית מהצוות שלי. כדי להפוך את המצע עבור micropatterning, לטפל 18 מילימטר מעגלי זכוכית coverslips על ידי הפעלת אוויר או פלזמה במשך חמש דקות לפני הצבת coverslips ב יבוש עם 100 microliters של triethoxysilane במשך שעה אחת, ואז דגירה פתרון של PEG-SVA ב 100 מיליגרם למיליליטר במשך שעה אחת.
לתצהיר ג'ל, בסוף הדגירה, מוסיפים שלושה מיקרוליטרים של PLPP ו -50 מיקרוליטרים של אתנול מוחלט למרכז המגלשה ומחכים עד שהוא מתייבש לחלוטין. עבור micropatterning שקופית זכוכית, הר את הכיסוי בתא לודין ומניחים את התא על הבמה של מיקרוסקופ מצויד במערכת מיקוד אוטומטי. לאחר ההדמיה, טען את תמונות המיקרופטרן לתוכנה.
לאחר רצף תאורת UV אוטומטי, השתמש בפיפטה כדי לשטוף את ה- PLPP מהכיסוי בהרחבה עם PBS. לאחר מכן דגירה את הכיסוי עם 50 מיקרוגרם למיליליטר של למינצין במשך 30 דקות, ואחריו לשטוף עוד עם PBS כפי שהוכח. כדי להקים תרבות נוירון היפוקמפוס עכברוש עוברי על coverslips micropattern, לאחר הכביסה האחרונה, rehydrate שקופיות זכוכית עם מדיום תרבות התא העצבי.
זרע חמש פעמים 10 לנוירונים ההיפוקמפוסים החולדה הרביעי מושעה במדיום Neurobasal מועשר 3% סרום סוס לסנטימטר מרובע על כל כיסוי micropatterned עבור דגירה 24 שעות ביממה ב 5% פחמן דו חמצני חממה ב 37 מעלות צלזיוס. תאי גליובלסטומה מנותקים צנטריפוגה במשך חמש דקות ב 1, 000 סל"ד ו resuspend גלולה במדיום תרבות תא גליובלסטומה, ולאחר מכן להפקיד פעם אחת 10 לתאי GBM השלישי על נוירונים micropatterned. להדמיית תאים חיים של התאים, הניחו את התרבות המשותפת על הבמה של מיקרוסקופ הפוך המצויד בתא תרמוסטט של 37 מעלות צלזיוס ובחרו את המטרה 20X.
לאחר מכן השתמש בארגז הכלים רב מימדי רכישות בתוכנת מיקרוסקופ לרכוש תמונות עגבניות GFP ברייטפילד חי epifluorescence כל שתי דקות במשך 12 שעות ב 16 עמדות שונות המבוססות על מספר דפוסים עם נוירונים. לניתוח רשת עצבית, לאחר ההדמיה, בחר תמונה אחת מהערימה. לחצו לחיצה ימנית על כלי הרשת לפתיחת תיבת הדו-שיח המתאימה של האפשרויות ולהתאמת ההגדרות ליצירת פילוח מדויק של התמונות.
לחץ על אישור. לחצו לחיצה שמאלית על כלי הרשת כדי לשכפל את התמונה שנבחרה ולפצל את התמונה לערוצי הצבעים האדומים, האפורים והירוקים. בחרו בערוץ האפור ובצעו שיפור מתיחת ניגודיות לשיפור ההפרדה בין האזורים השונים. השתמש בגלאי קצה Sobel כדי לבצע את התולעת של עיבוד אותות דו-מימדית כמקובץ תחת הפקודה find edge.
לסינון כפול, החל טשטוש גאוסיאני ומסנן חציוני כדי להפחית את הרעש ולהחליק את אות האובייקט. להמרה למסיכה, בצעו אלגוריתמי סף מותאמים לקבלת תמונה בינארית עם פיקסלים בשחור-לבן. לאחר מכן, שלד אזור התא לרשת פשוטה ולהשתמש חלקיקי מסנן כדי להסיר חלקיקים קטנים שאינם מרושתים בתוצאות.
חלקיקי מסנן רשת בתמונת רשת. לקבלת ערוצים אדומים וירוקים, בצעו סינון כפול והמירו למסיכה כפי שהוכח בשיטת הסף המותאמת. השתמש לנתח חלקיקים כדי לקבוע את מורפולוגיה התא בתמונה הירוקה הבינארית.
השתמש או המפעיל כדי למזג את כל הערוצים באמצעות אזורי העניין שלהם להתאים מחדש את הצבע הראשוני שלהם לתוך תמונת RGB פשוטה. כדי לבצע ניתוח תנועתיות של תא יחיד, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על כלי המעקב אחר תאים בודדים כדי לפתוח את תיבת הדו-שיח המתאימה של האפשרויות ולהתאים את ההגדרות ליצירת פילוח מדויק של תמונות. לחץ על אישור ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על מעקב אחר תא בודד כדי להסיר את הערוץ האפור.
ליצירת תמונה המתאימה לערימת תמונות לפי השעה, החל הקרנת Z וסינון כפול והמרה כדי להסוות את השבילים שהשאירו התאים. הסר את החלקיקים הקטנים מהתמונה הבינארית האדומה והירוקה כפי שהוכח. השתמש בכלי אזור העניין כדי לבחור כל מיתאר של מעקב התא וסמן את התיבה זיהוי קצה דילוג בחלון תיבת הדו-שיח אפשרויות.
בודדו את הערוץ האדום בערימה המקורית ובחרו אזור מעניין אחד. סנן פעמיים את כל התמונות והמר למסיכה כדי לקבוע את מיקום ה- XY הצנטרואיד של כל גרעין בינארי. ניתן להשתמש במיקומים XY כדי לחשב את התזוזה הריבועית הממוצעת, את יחס הכיווניות ואת המהירות הממוצעת עבור התא.
לניתוח מעקב אחר תאים מרובים, לחצו לחיצה ימנית על כלי המעקב כדי לפתוח את תיבת הדו-שיח המתאימה של האפשרויות ולהתאים את ההגדרות ליצירת פילוח מדויק של תמונות. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על כלי המעקב כדי להסיר את הערוץ האפור. פצל את הערוצים האדומים והירוקים, סנן פעמיים והמר למסיכה.
לאחר מכן השתמש בפקודה מחשבון התמונה עם האופרטור ו כדי למזג את הערוצים ולהשאיר רק את אות הגרעין הממוקם בתוך הקרומים ולחשב את התוויית המסלול, ממוצע תזוזה מרובעת, יחס כיווניות ומהירות ממוצעת עבור התאים כפי שהוכח. GBM פלואורסצנטי במשותף עם נוירונים בדוגמת לשנות במהירות את צורתם ולהראות הגירה לאורך הרחבות עצביות בתנועה אקראית. תאי GBM הנזרעים על גבי נוירונים מציגים צורה מוארכת עם בליטות מרובות העוקבות אחר מסלולי הנוירונים בעוד התאים שומרים על צורתם המעוגלת כאשר הם מתורבתים על למין.
בשלבים מאוחרים יותר של התרבות, בליטות דקות המקשרות לתאים ניתן לראות בתרבויות משותפות עצביות GBM. תאי GBM הנזרעים על גבי נוירונים מדגימים יכולת נדידה גדולה יותר מאשר תאי GBM הנזרעים על למין כפי שנצפה בחלקות מסלול אלה. ניתוח המפגש הפלואורסצנטי של התאים מראה כי במשך 500 דקות תצפית, נדידת תאים יותר נצפתה כאשר spheroids הם במשותף עם נוירונים מאשר כאשר התאים מתורבתים על למינצין בלבד.
ואכן עד סוף הניתוח, כמעט מחצית מהתבנית מכוסה בתאי GBM בעוד הכדורואידים המתורבתים על למינין נשארים לא מרוסנים לכיסוי. בהתאם לשאלות הביולוגיות שאתה רוצה לענות, יש לדאוג כי עיצוב הדפוס וגם את צפיפות התא מייצגים את התנאים in vivo. התאים יכולים להיות קבועים ודימוי על ידי מיקרוסקופיה confocal.
הדמיה חיה אפשרית גם מכיוון שהשיטה שלנו אינה פוגעת ביכולות ההדמיה. טכניקה זו מתאימה היטב לחקר אינטראקציה מולקולרית, כגון חילופי מטבוליים בין תאי גליובלסטומה ותאי עצב. זה מאפשר לחקור תהליכים ביולוגיים פונקציה.
ניסויים בעלי תפוקה גבוהה יכולים להיעשות גם למטרות קליניות.
