Glioblastomalar, invaziv profili yüksek olan yıkıcı beyin tümörleridir. Bu ortak kültür sistemi, hastalarda gözlenen invaziv rotalardan birini yeniden canlandırmak için nöronlar üzerindeki glioblastoma hücrelerinin göçini taklit eder. Ortak kültür modelimizin geometrisi ve bileşimi tam olarak kontrol edilir.
Daha iyi bir tekrarlanabilirliği ve karmaşık biyolojik süreçlerin basit bir nicelemesini kolaylaştırır. Bu yöntem, yeni ayrışmış glioblastoma hücreleri ve nöronları birlikte kült ederek klinik tanıya uyarlanabilir. Klinik sonuç olarak çok önemli olan klinik indeksi tanımlar.
Yöntemimiz, fibroblastlar veya bağışıklık hücreleri gibi diğer göç eden hücreleri ölçmek için de kullanılabilir. Prosedürü gösteren joris Guyon olacak, ekibimden bir doktora öğrencisi. Mikropatterning için bir substrat yapmak için, kapakları bir saat boyunca 100 mikrolitre triethoxysilane ile bir desiccator'a yerleştirmeden önce beş dakika boyunca hava veya plazma aktivasyonu ile 18 milimetre dairesel cam kapak örtülerini tedavi edin, ardından bir saat boyunca milimetre başına 100 miligramda bir PEG-SVA çözeltisini kuluçkaya bırakın.
Jel biriktirme için, inkübasyonun sonunda, slaytın ortasına üç mikrolitre PLPP ve 50 mikrolitre mutlak etanol ekleyin ve tamamen kuruyana kadar bekleyin. Cam slayt mikropatterning için, kapak kapağını bir Ludin odasına monte edin ve hazneyi otomatik odaklama sistemi ile donatılmış bir mikroskop aşamasına yerleştirin. Görüntülemeden sonra, mikropattern görüntüleri yazılıma yükleyin.
Otomatik UV aydınlatma diziliminden sonra, PLPP'yi kapaktan PBS ile kapsamlı bir şekilde yıkamak için bir pipet kullanın. Daha sonra kapak sapını mililitre laminin başına 50 mikrogram ile 30 dakika kuluçkaya yatırın, ardından gösterildiği gibi PBS ile başka bir yıkama yapın. Mikropattern kapak örtülerinde embriyonik bir sıçan hipokampal nöron kültürü kurmak için, son yıkamadan sonra, cam slaytları nöronal hücre kültürü ortamı ile yeniden sulandırın.
Nörobasal ortamda askıya alınan dördüncü sıçan hipokampal nöronlara beş kez 10 tohum, 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit inkübatöründe 24 saatlik bir inkübasyon için her mikropatterned kapak kapağına santimetrekare başına% 3 at serumu ile zenginleştirilmiştir. Santrifüj, glioblastoma hücrelerini 1.000 RPM'de beş dakika boyunca ayrıştırdı ve peleti glioblastoma hücre kültürü ortamına yeniden depoladı, ardından mikropatterned nöronlar üzerinde üçüncü GBM hücrelerine bir kez 10 kez biriktirdi. Hücrelerin canlı hücre görüntülemesi için, ortak kültürü 37 santigrat derece termostat odası ile donatılmış ters bir mikroskop aşamasına yerleştirin ve 20X hedefini seçin.
Daha sonra mikroskop yazılımındaki çok boyutlu satın alma araç kutusunu kullanarak nöronlu desenlerin sayısına göre 16 farklı pozisyonda 12 saat boyunca her iki dakikada bir canlı Brightfield ve epifluoresanS GFP domates görüntüleri elde edin. Nöronal ağ analizi için, görüntülemeden sonra yığından bir görüntü seçin. İlgili seçenekler iletişim kutusunu açmak ve görüntülerin kesin bir segmentasyonunu oluşturmak için ayarları yapmak için ağ aracını sağ tıklatın.
Tamam'ı tıklatın. Seçili görüntüyü çoğaltmak ve görüntüyü kırmızı, gri ve yeşil renk kanallarına bölmek için ağ aracını sol tıklatın. Gri kanalı seçin ve farklı alanlar arasındaki ayrımı iyileştirmek için kontrast uzatma geliştirmesi gerçekleştirin. 2D sinyal işleme konvoksiyonunu find edge komutu altında gruplandırıldığı şekilde gerçekleştirmek için Sobel kenar dedektörünü kullanın.
Çift filtreleme için, gürültüyü azaltmak ve nesne sinyalini yumuşatmak için Gauss bulanıklığı ve ortanca filtre uygulayın. Maskeye dönüştürmek için, siyah beyaz pikselli ikili bir resim elde etmek için uyarlanmış eşik algoritmaları çalıştırın. Ardından, hücre alanını basit bir ağa iskeletleştirin ve sonuçlardaki küçük ağ dışı parçacıkları gidermek için filtre parçacıklarını kullanın.
Ağ görüntüsündeki ağ filtresi parçacıkları. Kırmızı ve yeşil kanallar elde etmek için, uyarlanmış eşikleme yöntemini kullanarak gösterildiği gibi çift filtreleme gerçekleştirin ve maskeye dönüştürün. İkili yeşil görüntüdeki hücre morfolojisini belirlemek için çözümleme parçacıklarını kullanın.
İlgi çekici bölgelerini kullanarak tüm kanalları birleştirmek ve ilk renklerini basit bir RGB görüntüsüne yeniden yönlendirmek için veya işlecini kullanın. Tek hücreli hareketlilik analizi yapmak için, tek hücreli izleme aracını sağ tıklatarak ilgili seçenekler iletişim kutusunu açın ve görüntülerin kesin bir segmentasyonunu oluşturmak için ayarları yapın. Tamam'ı tıklatın ve gri kanalı kaldırmak için tek hücreli izlemeyi sol tıklatın.
Zamana göre bir görüntü yığınına karşılık gelen bir görüntü oluşturmak için Z projeksiyonu ve çift filtre uygulayın ve hücrelerin bıraktığı izleri maskelemek için dönüştürün. Gösterildiği gibi ikili kırmızı ve yeşil görüntüden küçük parçacıkları çıkarın. Hücre izlemenin her konturunun seçilmesi ve seçenekler iletişim penceresinde kenar algılamayı atla kutusunun işaret edilmesi için ilgi alanı aracını kullanın.
Kırmızı kanalı özgün yığında yalıtın ve ilgi çekici bir bölge seçin. Tüm görüntüleri çift filtreleyin ve her binarized çekirdeğin centroid XY konumunun belirlenmesini sağlamak için maskeye dönüştürün. XY konumları, hücrenin ortalama kare yer değiştirme, yön oranı ve ortalama hızını hesaplamak için kullanılabilir.
Birden çok hücre izleme analizi için, ilgili seçenekler iletişim kutusunu açmak için izleme aracını sağ tıklatın ve görüntülerin kesin bir segmentasyonunu oluşturmak için ayarları yapın. Gri kanalı kaldırmak için izleme aracını sol tıklatın. Kırmızı ve yeşil kanalları bölün, çift filtreyi filtreleyin ve maskeye dönüştürün.
Ardından, yalnızca membranlarda bulunan çekirdek sinyalini bırakan kanalları birleştirmek ve gösterilen gibi hücreler için yörünge grafiğini, ortalama kare yer değiştirmeyi, yön oranını ve ortalama hızı hesaplamak için ve işleci ile görüntü hesaplayıcı komutunu kullanın. Desenli nöronlarla birlikte kültürlenen floresan GBM, şekillerini hızla değiştirir ve rastgele bir hareketle nöronal uzantılar boyunca göçü gösterir. Nöronlara tohumlanan GBM hücreleri, hücreler laminin üzerinde kültürlendiğinde yuvarlatılmış şekillerini korurken nöron izlerini takip eden birden fazla çıkıntı ile uzun bir şekil gösterir.
Kültürün sonraki aşamalarında, GBM nöronal ortak kültürlerinde hücrelere bağlanan ince çıkıntılar gözlenebilir. Nöronlara tohumlanan GBM hücreleri, bu yörünge alanlarında gözlemlendiği gibi laminin üzerine tohumlanmış GBM hücrelerinden daha fazla göçmen kapasitesi göstermektedir. Hücrelerin floresan birleştiği analizi, 500 dakikalık bir gözlem süresi boyunca, küreseller nöronlarla birlikte kültürlendiğinde, hücrelerin sadece laminin üzerinde kültürlendiğinden daha fazla hücre göçü gözlendiğini göstermektedir.
Gerçekten de analizin sonunda, kalıbın neredeyse yarısı GBM hücreleriyle kaplanırken, laminin üzerinde kültürlenen küreseller kapak ucuna bağlı kalmaz. Cevaplamak istediğiniz biyolojik sorulara bağlı olarak, desen tasarımının ve ayrıca hücre yoğunluğunun in vivo koşulları temsil etmesine dikkat edilmelidir. Hücreler konfokal mikroskopi ile sabitlenebilir ve görüntülenebilir.
Yöntemimiz görüntüleme yeteneklerini bozmadığı için canlı görüntüleme de mümkündür. Bu teknik, glioblastoma hücreleri ve nöronlar arasındaki metabolik değişimler gibi moleküler etkileşimi incelemek için çok uygundur. Fonksiyon biyolojik süreçlerinin araştırılmasına izin verir.
Yüksek verimli deneyler klinik amaçlar için de yapılabilir.
