Les glioblastomes sont des tumeurs cérébrales dévastatrices avec un profil invasif élevé. Ce système de co-culture imite la migration des cellules du glioblastome sur les neurones pour récapituler l’une des voies invasives observées chez les patients. La géométrie et la composition de notre modèle de co-culture sont contrôlées avec précision.
Il facilite une meilleure reproductibilité et aussi une quantification simple des processus biologiques complexes. Cette méthode peut être adaptée au diagnostic clinique en co-cultivant des cellules et des neurones de glioblastome fraîchement dissociés. Il définit un index clinique, ce qui est très important en tant que résultat clinique.
Notre méthode peut également être utilisée pour quantifier d’autres cellules migratrices, telles que les fibroblastes ou les cellules immunitaires. Joris Guyon, un doctorant de mon équipe, fera la démonstration de la procédure. Pour fabriquer un substrat pour le micropatterning, traiter les lamelles circulaires de verre de 18 millimètres par activation de l’air ou du plasma pendant cinq minutes avant de placer les lamelles dans un dessiculateur avec 100 microlitres de triéthoxysilane pendant une heure, puis incuber une solution de PEG-SVA à 100 milligrammes par millilitre pendant une heure.
Pour le dépôt de gel, à la fin de l’incubation, ajoutez trois microlitres de PLPP et 50 microlitres d’éthanol absolu au centre de la lame et attendez qu’elle sèche complètement. Pour le micropatternage de lames de verre, montez la lame de couverture dans une chambre Ludin et placez la chambre sur la scène d’un microscope équipé d’un système de mise au point automatique. Après l’imagerie, chargez les images micropattern dans le logiciel.
Après le séquençage automatique de l’éclairage UV, utilisez une pipette pour laver abondamment le PLPP de la lamelle de couverture avec du PBS. Incuber ensuite la lame de couverture avec 50 microgrammes par millilitre de laminine pendant 30 minutes, suivi d’un autre lavage avec pbs comme démontré. Pour mettre en place une culture de neurones de l’hippocampe de rat embryonnaire sur les lamules de couverture du micropattern, après le dernier lavage, réhydratez les lames de verre avec un milieu de culture cellulaire neuronale.
Ensemencez cinq fois 10 à la quatrième neurones de l’hippocampe de rat en suspension dans un milieu neurobasal enrichi avec 3% de sérum de cheval par centimètre carré sur chaque lamelle micropatternée pour une incubation de 24 heures dans un incubateur à 5% de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius. Centrifuger les cellules de glioblastome dissociées pendant cinq minutes à 1 000 RPM et remettre en suspension le culot dans le milieu de culture cellulaire du glioblastome, puis déposer une fois 10 aux troisièmes cellules GBM sur les neurones micropatternés. Pour l’imagerie des cellules vivantes des cellules, placez la co-culture sur la scène d’un microscope inversé équipé d’une chambre thermostatée de 37 degrés Celsius et sélectionnez l’objectif 20X.
Ensuite, utilisez la boîte à outils d’acquisition multidimensionnelle dans le logiciel de microscope pour acquérir des images de tomates Brightfield et GFP en direct toutes les deux minutes pendant 12 heures dans 16 positions différentes en fonction du nombre de modèles avec des neurones. Pour l’analyse de réseau neuronal, après l’imagerie, sélectionnez une image dans la pile. Cliquez avec le bouton droit sur l’outil réseau pour ouvrir la boîte de dialogue des options correspondante et ajuster les paramètres pour produire une segmentation précise des images.
Cliquez sur OK. Cliquez avec le bouton gauche de la souris sur l’outil réseau pour dupliquer l’image sélectionnée et diviser l’image en couches de couleur rouge, gris et vert. Sélectionnez la couche grise et améliorez l’étirement du contraste pour améliorer la séparation entre les différentes zones. Utilisez le détecteur de bord Sobel pour effectuer la convolution de traitement du signal 2D comme regroupé sous la commande find edge.
Pour le double filtrage, appliquez un flou gaussien et un filtre médian pour réduire le bruit et lisser le signal de l’objet. Pour convertir en masque, exécutez des algorithmes de seuil adaptés pour obtenir une image binaire avec des pixels noirs et blancs. Ensuite, squelettez la zone cellulaire en un réseau simple et utilisez des particules de filtre pour éliminer les petites particules non en réseau dans les résultats.
Filtrer les particules réseau dans une image réseau. Pour obtenir des canaux rouges et verts, effectuez un double filtrage et convertissez-les en masque comme démontré à l’aide de la méthode de seuillage adaptée. Utilisez analyser les particules pour déterminer la morphologie des cellules dans l’image verte binaire.
Utilisez l’opérateur or pour fusionner tous les canaux à l’aide de leurs régions d’intérêt et réajuster leur couleur initiale en une image RVB simple. Pour effectuer une analyse de motilité à cellule unique, cliquez avec le bouton droit sur l’outil de suivi de cellule unique pour ouvrir la boîte de dialogue d’options correspondante et ajuster les paramètres pour produire une segmentation précise des images. Cliquez sur OK et cliquez avec le bouton gauche sur le suivi à cellule unique pour supprimer le canal gris.
Pour générer une image correspondant à une pile d’images en fonction de l’heure, appliquez une projection Z et un double filtre et convertissez-la pour masquer les traînées laissées par les cellules. Retirez les petites particules de l’image binaire rouge et verte comme illustré. Utilisez l’outil région d’intérêt pour sélectionner chaque isoligne de la trace de cellule et cochez la case de détection des tronçons d’évitement dans la boîte de dialogue des options.
Isolez le canal rouge sur la pile d’origine et sélectionnez une région d’intérêt. Double filtrez toutes les images et convertissez-les en masque pour permettre de déterminer la position XY du centroïde de chaque noyau binarisé. Les positions XY peuvent être utilisées pour calculer le déplacement carré moyen, le rapport de directionnalité et la vitesse moyenne de la cellule.
Pour l’analyse de suivi de plusieurs cellules, cliquez avec le bouton droit sur l’outil de suivi pour ouvrir la boîte de dialogue d’options correspondante et ajuster les paramètres pour produire une segmentation précise des images. Faites un clic gauche sur l’outil de suivi pour supprimer le canal gris. Fractionnez les canaux rouges et verts, doublez le filtre et convertissez-les en masque.
Utilisez ensuite la commande de calculatrice d’image avec l’opérateur and pour fusionner les canaux en ne laissant que le signal du noyau situé dans les membranes et calculez le tracé de trajectoire, le déplacement carré moyen, le rapport de directionnalité et la vitesse moyenne des cellules, comme illustré. Le GBM fluorescent co-cultivé avec des neurones à motifs modifie rapidement leur forme et montre une migration le long des extensions neuronales dans un mouvement aléatoire. Les cellules GBM ensemencées sur les neurones présentent une forme allongée avec de multiples saillies qui suivent les traces neuronales tandis que les cellules conservent leur forme arrondie lorsqu’elles sont cultivées sur de la laminine.
Aux stades ultérieurs de la culture, de minces saillies se liant aux cellules peuvent être observées dans les co-cultures neuronales GBM. Les cellules GBM ensemencées sur les neurones démontrent une plus grande capacité migratoire que les cellules GBM ensemencées sur la laminine comme observé dans ces diagrammes de trajectoire. L’analyse de la confluence fluorescente des cellules démontre que sur une période d’observation de 500 minutes, on observe plus de migration cellulaire lorsque les sphéroïdes sont co-cultivés avec des neurones que lorsque les cellules sont cultivées sur la laminine seule.
En effet à la fin de l’analyse, près de la moitié du motif est recouverte de cellules GBM tandis que les sphéroïdes cultivés sur la laminine restent non accompagnés à la lame de couverture. Selon les questions biologiques auxquelles vous souhaitez répondre, il faut veiller à ce que la conception du motif et la densité cellulaire soient représentatives des conditions in vivo. Les cellules peuvent être fixées et es microscopie confocale.
L’imagerie en direct est également possible car notre méthode n’altère pas les capacités d’imagerie. Cette technique est bien adaptée à l’étude des interactions moléculaires, telles que les échanges métaboliques entre les cellules du glioblastome et les neurones. Il permet l’exploration des processus biologiques fonctionnels.
Des expériences à haut débit peuvent également être réalisées à des fins cliniques.
