교모세포종은 높은 침습적 인 프로필을 가진 파괴적인 뇌종양입니다. 이 공동 배양 시스템은 환자에서 관찰된 침략적인 경로 의 한을 recapituure하는 신경에 교모 세포 이주를 모방합니다. 공동 배양 모델의 형상과 구성은 정확하게 제어됩니다.
그것은 더 나은 재현성을 용이하게하고 또한 복잡한 생물학적 과정의 간단한 정량화. 이 방법은 새로 해리된 교모세포종 세포 및 뉴런을 공동 배양하여 임상 진단에 적응할 수 있다. 그것은 임상 결과로 매우 중요한 임상 지수를 정의합니다.
우리의 방법은 또한 섬유아세포 또는 면역 세포와 같은 그밖 이주세포를 정량화하기 위하여 이용될 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 우리 팀의 박사 과정 학생인 조리스 가이온(Joris Guyon)이 될 것입니다. 마이크로패터닝용 기판을 만들기 위해 공기 또는 플라즈마 활성화로 18mm 원형 유리 커버립을 5분 동안 처리한 후 1시간 동안 트리에톡시실레인 100마이크로리터의 디시케이터에 커버립을 넣은 다음, 1시간 동안 페그-SVA 용액을 1밀리리터당 100밀리그램으로 배양합니다.
겔 증착의 경우, 인큐베이션의 끝에 PLPP 3마이크로리터와 절대 에탄올 50 마이크로리터를 슬라이드 중앙에 넣고 완전히 건조될 때까지 기다립니다. 유리 슬라이드 마이크로패터닝의 경우, 루딘 챔버에 커버슬립을 장착하고 자동 초점 시스템이 장착된 현미경의 단계에 챔버를 놓습니다. 이미징 후 마이크로패턴 이미지를 소프트웨어에 로드합니다.
자동 UV 조명 시퀀싱 후 파이펫을 사용하여 PBS로 커버슬립에서 PLPP를 광범위하게 세척합니다. 그런 다음 커버슬립을 라미닌 밀리리터당 50마이크로그램으로 30분 간 배양한 다음 PBS로 또 다른 세척을 시연합니다. 마이크로패턴 커버립에 배아 쥐 해마 뉴런 배양을 설정하려면, 마지막 세척 후, 신경 세포 배양 배지로 유리 슬라이드를 재수화한다.
씨앗 5 회 10 신경 물질 배지에 매달린 네 번째 쥐 해마 뉴런은 37섭에서 5 %의 이산화탄소 인큐베이터에서 24 시간 배양에 각 마이크로 패턴 커버 슬립에 평방 센티미터 당 3 %의 말 세럼으로 농축. 원심분리기는 교모세포종 세포를 1, 000 RPM에서 5분 동안 해리시키고 교모세포종 세포 배양 배지에서 펠릿을 재중단한 다음, 마이크로패턴 뉴런을 통해 10번10을 제3GBM 세포에 증착한다. 세포의 살아있는 세포 화상 진찰을 위해, 37섭씨 온도 조절챔버를 갖춘 반전된 현미경의 단계에 공동 배양을 놓고 20X 목표를 선택하십시오.
그런 다음 현미경 소프트웨어의 다차원 획득 툴박스를 사용하여 뉴런패턴 수에 따라 16개의 다른 위치에서 12시간 동안 2분마다 라이브 브라이트필드 및 피불화 GFP 토마토 이미지를 획득합니다. 신경 네트워크 분석을 위해 이미징 후 스택에서 하나의 이미지를 선택합니다. 네트워크 도구를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 해당 옵션 대화 상자를 열고 설정을 조정하여 이미지의 정확한 세분화를 생성합니다.
확인을 클릭합니다. 네트워크 도구를 왼쪽 단추로 클릭하여 선택한 이미지를 복제하고 이미지를 빨간색, 회색 및 녹색 채널로 분할합니다. 회색 채널을 선택하고 대비 스트레치 향상을 수행하여 서로 다른 영역 간의 분리를 개선합니다. Sobel 가장자리 검출기를 사용하여 찾기 가장자리 명령에서 그룹화된 대로 2D 신호 처리 컨볼루션을 수행합니다.
이중 필터링의 경우 가우시안 블러와 중앙값 필터를 적용하여 노이즈를 줄이고 물체 신호를 부드럽게 합니다. 마스크로 변환하려면 적응된 임계값 알고리즘을 실행하여 흑백 픽셀이 있는 이진 그림을 가져옵니다. 다음으로 셀 영역을 간단한 네트워크로 골격화하고 필터 입자를 사용하여 결과에서 작은 비네트워크 입자를 제거합니다.
네트워크 이미지의 네트워크 필터 파티클입니다. 빨간색 및 녹색 채널을 얻으려면 조정된 임계값 을 사용하여 입증된 대로 이중 필터링을 수행하고 마스크로 변환합니다. 분석 입자를 사용하여 이진 녹색 이미지의 세포 형태를 결정합니다.
또는 연산자를 사용하여 관심 영역을 사용하여 모든 채널을 병합하고 초기 색상을 간단한 RGB 이미지로 재조정합니다. 단일 셀 운동성 분석을 수행하려면 단일 셀 추적 도구를 마우스오른쪽 단추로 클릭하여 해당 옵션 대화 상자를 열고 설정을 조정하여 이미지의 정확한 세분화를 생성합니다. 한 셀 추적을 확인하고 왼쪽 단추로 클릭하여 회색 채널을 제거합니다.
시간에 따라 이미지 스택에 해당하는 이미지를 생성하려면 Z 프로젝션 및 이중 필터를 적용하고 셀에 의해 남겨진 흔적을 마스크하도록 변환합니다. 설명한 대로 이진 빨간색 및 녹색 이미지에서 작은 입자를 제거합니다. 관심 영역 도구를 사용하여 셀 추적의 각 윤곽을 선택하고 옵션 대화 상자 창에서 건너뛰기 가장자리 감지 상자를 확인합니다.
원래 스택의 빨간색 채널을 분리하고 관심 영역 을 선택합니다. 모든 이미지를 이중 필터링하고 마스크로 변환하여 각 바이나드 핵의 중심 XY 위치가 결정되도록 합니다. XY 위치는 셀의 평균 제곱 변위, 방향성 비율 및 평균 속도를 계산하는 데 사용할 수 있습니다.
여러 셀 추적 분석을 보려면 추적 도구를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 해당 옵션 대화 상자를 열고 설정을 조정하여 이미지의 정확한 세분화를 생성합니다. 추적 도구를 왼쪽 단추로 클릭하여 회색 채널을 제거합니다. 빨간색 과 녹색 채널을 분할, 이중 필터, 마스크로 변환합니다.
그런 다음 영상 계산기 명령을 및 연산자와 사용하여 멤브레인 내에 위치한 핵 신호만 남기는 채널을 병합하고 궤적 플롯, 평균 제곱 변위, 방향성 비율 및 입증된 바와 같이 세포의 평균 속도를 계산한다. 패턴 뉴런과 공동 배양형형 형광GBM은 빠르게 모양을 수정하고 임의의 움직임으로 뉴런 확장을 따라 이주를 보여줍니다. 뉴런에 시드된 GBM 세포는 세포가 라미닌에서 배양될 때 둥근 모양을 유지하면서 뉴런 트랙을 따르는 여러 돌출부로 길쭉한 모양을 표시합니다.
문화의 후반 단계에서, 세포에 연결 하는 얇은 돌출 GBM 신경 공동 배양에서 관찰 될 수 있습니다. 뉴런에 시드된 GBM 세포는 이러한 궤적 플롯에서 관찰된 바와 같이 라미닌에 시드된 GBM 세포보다 더 큰 철새 용량을 보여 준다. 세포의 형광 성 합류의 분석은 500 분 관측 기간 동안, 세포가 혼자 라미닌에 배양 될 때보다 구체와 공동 배양 될 때 더 많은 세포 이동이 관찰된다는 것을 보여줍니다.
실제로 분석이 끝날 때까지 패턴의 거의 절반이 GBM 세포로 덮여 있으며 라미닌에서 배양된 스페로이드는 커버슬립에 부착되지 않은 상태로 유지됩니다. 당신이 대답하고자하는 생물학적 질문에 따라, 하나는 패턴 디자인과 또한 세포 밀도가 생체 내 조건을 대표한다는 것을주의해야한다. 세포는 공초점 현미경 검사법에 의해 고정되고 심을 수 있습니다.
우리의 방법이 이미징 기능을 손상시키지 않기 때문에 라이브 이미징도 가능합니다. 이 기술은 교모세포종 세포와 뉴런 사이 신진 대사 교류와 같은 분자 상호 작용을 공부하기에 적합합니다. 그것은 기능 생물학적 과정의 탐구를 허용합니다.
고처리량 실험은 임상 적 목적을 위해서도 수행 될 수 있습니다.
