Bu protokol, kriyo-elektron tomografisi için Plasmodium-falciparum ile enfekte olmuş kırmızı kan hücrelerinin vitreus lamellerinin hazırlanmasını özetlemektedir. Bu, parazitin sıtmaya nasıl neden olduğu hakkında ayrıntılı yapısal bilgilerin doğrudan gözlemlenmesini sağlar. Kriyo-elektron tomografisi, hücrelerin iç kısımları hakkında yüksek çözünürlüklü bilgileri kaydeder.
Proteinler hakkında üç boyutlu yapısal bilgileri ortaya çıkarmak için hesaplamalı olarak ekstrakte edilebilen ve ortalaması alınabilen tek protein komplekslerini in situ olarak gözlemlemek için yeterince güçlüdür. Bu protokol farklı hücre tipleri için kolayca uyarlanabilir ve kriyo-elektron tomografisi için vitreus lamel üretiminde yeni biri için bir başlangıç noktası olabilir. Bu, bugün protokolü uygulayacak olan Alejandra Carbajal.
Başlamak için, ızgara boyunca buz gradyanına özellikle dikkat eden bir ışık mikroskobu için bir CryoStage kullanarak donmuş bakır ızgaraları tarayın. Buzun daha ince alanlarındaki hücre kapsamı için ayrı ayrı ızgara karelerini kontrol edin. Cryo-FIB-SEM'e özgü Autogrid jantların önünü ve karşı tarafını işaretlemek için siyah silinmez bir işaretleyici kullanın.
Kırpılmış ızgarayı karbon tarafı yukarı bakacak şekilde Cryo-FIB-SEM mekiğine yükleyin ve hücrelerin yüzeyine dört nanometre kalınlığında karbon veya platin e-ışınlı döner kaplama uygulayın. Mekiği Cryo-FIB-SEM'e yükleyin ve her ızgaradaki hücre dağılımını SEM ile beş kilovoltta değerlendirin. Izgaradaki buz gradyanlarına bakmak için 100 güçte düşük büyütmeli bir genel bakış elde edin.
Ardından, tek tek ızgara karelerine bakmak için 5.000 güçte daha yüksek büyütmeli görüntüler çekin. Gaz enjeksiyon sistemi iğnesini ızgaranın üstündeki odaya sokarak ve organoplatin kaynağını bir buhar akışı üretmek için belirli bir süre için belirli bir sıcaklığa ısıtarak her ızgaranın yüzeyine iki mikrometre organoplatin kaplama uygulayın. Numuneyi gözlemlemek için, numuneyi ızgaranın düzlemi iyon ışınının insidans açısından yaklaşık 10 derece olacak şekilde eğin ve hem SEM hem de FIB görüntülerinde görülecek uygun bir ızgara karesinin merkezini hareket ettirin.
İyon ışınını düşük akımda kullanarak, bir ızgara karesinin merkezindeki hücreleri görselleştirmek için ızgarayı yüksek bir büyütmede inceleyin. Frezelemek için biri üç mikrometre kalınlığında korunan bir bölgenin üstünde ve altında olmak üzere iki dikdörtgen deseni işaretleyin. Ardından ışın ayarlarını seçin ve parlaklığı ve kontrastı ayarlayarak astigmatizmayı düzeltin.
Kurulum tamamlandıktan sonra, iyon ışını görünümünde ve aralıklı olarak SEM tarafından canlı ilerlemeyi izlerken 300 pikoamper akımda frezelemeye başlayın. Numune SEM görünümünde kontrol edilir ve ilk frezelemeden sonra, iyon ışını korunan bölgenin üstündeki ve altındaki numuneyi kırmadıysa, dikdörtgen desenlerin yüksekliğini artırarak daha fazla malzeme çıkarın. Lamelin üstündeki ve altındaki yüzey iyon ışını görünümünde tamamen pürüzsüz olduğunda frezelemeyi durdurun.
Frezeleme işlemini adım adım tekrarlayın, 300 nanometre kalınlığa ulaşana kadar her seferinde iyon ışını akımını azaltın. Her lamelin X Y Z konumunu kaydedin. Deneyin sonunda lamelleri parlatmak için, parlatılacak bir lamel grubu seçmek ve parlatma kökünü işaretlemek için düşük büyütmeli bir SEM genel bakışı kullanın.
Parlatma kökü işaretlendikten sonra, iki dikdörtgen desen arasındaki boşluğu 100 ila 200 nanometreye düşürün ve parlatmaya 30 pikoamperlik bir iyon ışını akımında başlayın. SEM ile ilerlemeyi iki ila üç kilovoltta izleyin. Lameldeki kontrast SEM tarafından kaybedildiğinde veya organoplatin kat veya lamelin kendisi bütünlüğünü kaybetmeye başladığında parlatmayı bırakın.
Her lamelin düşük büyütmeli SEM görüntülerini alın ve kaydedin. Deneyin tamamlanmasından sonra, mekiği mikroskoptan çıkarın. Izgaraları lameller ile çıkarın ve sıvı azot altında saklayın.
Izgaraları dikkatli kullanın. Morfolojiyi incelemek için, şizontlar E-64 inhibitörlerinde bileşik iki kullanılarak çıkışın farklı aşamalarında durduruldu. İkinci bileşiğin varlığında, konakçı kırmızı kan hücresindeki parazitoforöz membranlar ve çevresindeki hemoglobin arasındaki sınır iyi tanımlanmıştır.
Bozulmamış parazitoforöz vakuol veya PV'ler, tek bir hemozoin kristali kümesinde merozoitlerle doluydu. Bileşik iki senkronize şizont, E-64'e yıkandığında, PV membranı yırtıldı ve merozoitler RBC içinde yayıldı. Bir bakır ızgara üzerindeki iyi hücre dağılımının tipik bir örneği, iyi tanımlanmış bir çevre ve sağlam bir vakuol zarı olan büyük kırmızı kan hücrelerini gösterir.
Kısmen çökmüş bir konakçı kırmızı kan hücresi içinde, bireysel merozoitler küçük hücre kümeleri olarak görselleştirildi. Her şizontun merkezinde hemozoin kristallerinin konumunu gösteren siyah bir nokta vardı. Frezelemeden sonra, lamellerin pozisyonlarını belirlemek ve tomografi ile hedeflenecek uygun alanları bulmak için ızgaralar TEM'e yüklendi.
Örnek mikrografta, yakın zamanda bir merozoit tarafından istila edilmiş bir RBC görülebilir. Konakçı hücre kaynaklı membran ile çevrili merozoit, RBC sınırları içinde görülebilir. Merozitin apikal ucunda, hücreyi çevreleyen iki zar ve elektron yoğun mantar şeklindeki bir özellik ile ilişkili merozoitin tepesinde istiflenmiş dört zar açıkça görülebiliyordu.
Merozitin sitoplazması içinde, merozoit plazma membranı ile çok katmanlı bir vezikül arasında bir füzyon olayı tespit edildi. 230 nanometre kalınlığında bir lamelin ek bir TEM analizinde, E-64 ile muamele edilen olgun bir merozoitin tipik morfolojisi gözlenmiştir. Kırmızı kan hücresi zarı içinde, merozoit plazma zarı, iç zar kompleksi, polar halkalar, mikronemeler, roptriler ve nükleer zarf gibi organeller ile görülebilir.
Bu tekniğin en önemli kısmı, ince lamellerin tekrarlanabilir ve verimli bir şekilde üretilmesini sağlamak için ızgaraları optimize etmektir. Bu tekniğin daha da geliştirilmesi, araştırmacıların sıtma parazitleri içindeki tek proteinli molekülleri görselleştirmelerini ve sıtma çıkışındaki rollerini belirlemelerini sağlayacaktır.
