פרוטוקול זה מתאר את הכנת הזגוגית lamellae של פלסמודיום-falciparum-נגוע תאי דם אדומים עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרונים. זה מאפשר התבוננות ישירה במידע מבני מפורט על האופן שבו הטפיל גורם למלריה. טומוגרפיה Cryo-electron רשומות מידע ברזולוציה גבוהה על החלק הפנימי של תאים.
הוא חזק מספיק כדי לצפות בקומפלקסים של חלבונים בודדים באתרם, שניתן לחלץ אותם באופן חישובי וממוצע כדי לחשוף מידע מבני תלת-ממדי על חלבונים. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בקלות עבור סוגי תאים שונים והוא יכול להיות נקודת התחלה עבור מישהו חדש לייצר lamellae זגוגית עבור טומוגרפיה אלקטרונים קריו. זוהי אלחנדרה קרבחאל, שתבצע את הפרוטוקול היום.
כדי להתחיל, מסך את רשתות הנחושת הקפואות באמצעות CryoStage עבור מיקרוסקופ אור עם תשומת לב מיוחדת לשיפוע הקרח על פני הרשת. בדוק אם יש כיסוי תאים בריבועי רשת בודדים באזורים הדקים יותר של קרח. השתמש בטוש שחור בלתי ניתן למחיקה כדי לסמן את הצד הקדמי והנגדי של חישוקי Autogrid ספציפיים ל- Cryo-FIB-SEM.
טען את הרשת החתוכה למעבורת Cryo-FIB-SEM עם צד הפחמן כלפי מעלה, והחל ציפוי סיבובי של קרן אלקטרונית בעובי ארבעה ננומטר של פחמן או פלטינה על פני השטח של התאים. טען את המעבורת לתוך Cryo-FIB-SEM והערך את התפלגות התאים בכל רשת על ידי SEM בחמישה קילו-וולט. קבל סקירה כללית של הגדלה נמוכה בעוצמה של 100 כדי להסתכל על מעברי קרח ברחבי הרשת.
לאחר מכן צלם תמונות בהגדלה גבוהה יותר בעוצמה של 5, 000 כדי להסתכל על ריבועי רשת בודדים. יש למרוח שכבת אורגנופלטינום בגודל שני מיקרומטר על פני השטח של כל רשת על ידי החדרת מחט מערכת הזרקת הגז לתא שמעל הרשת וחימום מקור האורגנופלטינום לטמפרטורה קבועה למשך זמן מוגדר כדי לייצר זרימה של אדים. כדי לצפות בדגימה, הטו את הדגימה כך שמישור הרשת יהיה במרחק של כ-10 מעלות מזווית ההיארעות של קרן היונים, והזיזו את המרכז של ריבוע רשת מתאים שניתן לראות הן בתמונות SEM והן בתמונות FIB.
באמצעות קרן היונים בזרם נמוך, סקור את הרשת בהגדלה גבוהה כדי להציג באופן חזותי את התאים במרכז ריבוע רשת. סמן שתי תבניות מלבניות לטחינה, אחת מעל ואחת מתחת לאזור מוגן בעובי שלושה מיקרומטר. לאחר מכן בחר את הגדרות הקרן ותקן אסטיגמציה על ידי התאמת הבהירות והניגודיות.
לאחר השלמת ההתקנה, התחל לכרסם בזרם של 300 פיקואמפר תוך ניטור ההתקדמות החיה בתצוגת קרן היונים ולסירוגין על ידי SEM. הדגימה נבדקת בתצוגת SEM, ולאחר הכרסום הראשון, אם קרן היונים לא פרצה את הדגימה מעל ומתחת לאזור המוגן, יש להסיר חומר נוסף על ידי הגדלת גובה התבניות המלבניות. יש להפסיק את הכרסום כאשר המשטח שמעל ומתחת ללמלה חלק לחלוטין בתצוגת קרן היונים.
חזור על תהליך הכרסום בשלבים, תוך הפחתת זרם קרן היונים בכל פעם עד שמגיעים לעובי של 300 ננומטר. רשום את מיקום X Y Z של כל למלה. כדי ללטש את הלמלה בסוף הניסוי, השתמש בסקירת SEM בהגדלה נמוכה כדי לבחור קבוצת למלה לליטוש ולסמן את שורש הליטוש.
לאחר סימון שורש הליטוש, צמצמו את המרווח בין שתי התבניות המלבניות ל-100 עד 200 ננומטר והתחילו את הליטוש בזרם קרן יונים של 30 פיקואמפר. עקוב אחר ההתקדמות באמצעות SEM בשניים עד שלושה קילו-וולט. הפסק ללטש כאשר הניגודיות בלמלה אובדת על ידי SEM או כאשר ציפוי האורגנופלטינום או הלמלה עצמה מתחילים לאבד שלמות.
רכוש ושמור תמונות SEM בהגדלה נמוכה של כל למלה. לאחר השלמת הניסוי, הסר את המעבורת מהמיקרוסקופ. מוציאים את הרשתות עם lamellae ולאחסן אותם תחת חנקן נוזלי.
טפל ברשתות בזהירות. כדי לחקור את המורפולוגיה, הסכיזונטים נעצרו בשלבים שונים של יציאה באמצעות תרכובת שתיים במעכבי E-64. בנוכחות תרכובת שתיים, הגבול בין הקרומים הטפיליטופורים לבין ההמוגלובין שמסביב בתא הדם האדום המארח הוגדר היטב.
הוואקול הטפילי השלם, או PVs, היה ארוז במרוזואיטים באשכול יחיד של גבישי המוזואין. כאשר שני סכיזונטים מסונכרנים נשטפו לתוך E-64, קרום PV נקרע והמרוזואיטים התפשטו בתוך RBC. דוגמה טיפוסית לפיזור תאים טוב על רשת נחושת מראה תאי דם אדומים גדולים עם פריפריה מוגדרת היטב וקרום חלל שלם.
בתוך תא דם אדום מארח שהתמוטט חלקית, המרוזואיטים הבודדים הוצגו כצבירי תאים קטנים. לכל סכיזונט היה כתם שחור במרכזו המציין את מיקומם של גבישי ההמוזואין. לאחר הכרסום, הרשתות הועמסו לתוך TEM כדי לזהות את המיקומים של lamellae ולמצוא אזורים מתאימים למטרה על ידי טומוגרפיה.
במיקרוגרף הדגימה ניתן לראות RBC שאליו פלש לאחרונה מרוזואיט. את המרוזואיט המוקף בקרום שמקורו בתא המארח ניתן היה לראות בתוך גבולות ה-RBC. בקצה האפי של המרוזויט נראו בבירור שני הקרומים המקיפים את התא וארבעה קרומים שנערמו בקודקוד המרוזואיט הקשור לתכונה צפופה בצורת פטרייה צפופה אלקטרונים.
בתוך הציטופלסמה של המרוזויט זוהה אירוע איחוי בין קרום הפלזמה המרוזואיטית לבין שלפוחית רב-שכבתית. בניתוח TEM נוסף של למלה בעובי 230 ננומטר, נצפתה המורפולוגיה האופיינית של מרוזואיט בוגר שטופל ב- E-64. בתוך קרום תאי הדם האדומים, ניתן לראות את קרום הפלזמה של המרוזואיטים עם אברונים כמו קומפלקס הממברנה הפנימית, טבעות קוטביות, מיקרונמים, ראופטריות ומעטפת הגרעין.
החלק החשוב ביותר בטכניקה זו הוא אופטימיזציה של הרשתות כדי לאפשר ייצור יעיל ושניתן לשכפל של למלה דקה. פיתוח נוסף של טכניקה זו יאפשר לחוקרים לדמיין מולקולות חלבון יחיד בתוך טפילי מלריה ולקבוע את תפקידן ביציאת המלריה.
