Este protocolo describe la preparación de láminas vítreas de glóbulos rojos infectados con Plasmodium-falciparum para la criotomografía electrónica. Esto permite la observación directa de información estructural detallada sobre cómo el parásito causa la malaria. La criotomografía electrónica registra información de alta resolución sobre el interior de las células.
Es lo suficientemente potente como para observar complejos de proteínas individuales in situ, que pueden extraerse computacionalmente y promediarse para revelar información estructural tridimensional sobre las proteínas. Este protocolo se puede adaptar fácilmente para diferentes tipos de células y puede ser un punto de partida para alguien nuevo en la producción de láminas vítreas para la tomografía crioelectrónica. Se trata de Alejandra Carbajal, quien estará llevando a cabo el protocolo hoy.
Para comenzar, examine las rejillas de cobre congelado utilizando un CryoStage para un microscopio óptico con especial atención al gradiente de hielo a través de la rejilla. Verifique los cuadrados de cuadrícula individuales para la cobertura celular en las áreas más delgadas de hielo. Utilice un marcador negro indeleble para marcar la parte delantera y el lado opuesto de las llantas Autogrid específicas de Cryo-FIB-SEM.
Cargue la rejilla recortada en el transbordador Cryo-FIB-SEM con el lado de carbono hacia arriba y aplique una capa giratoria de haz electrónico de carbono o platino de cuatro nanómetros de espesor a la superficie de las células. Cargue la lanzadera en el Cryo-FIB-SEM y evalúe la distribución celular en cada red mediante SEM a cinco kilovoltios. Tome una visión general de bajo aumento a 100 potencias para observar los gradientes de hielo en toda la red.
Luego tome imágenes de mayor aumento a 5, 000 de potencia para mirar cuadrados de cuadrícula individuales. Aplique una capa organoplatino de dos micrómetros a la superficie de cada rejilla insertando la aguja del sistema de inyección de gas en la cámara sobre la rejilla y calentando la fuente de organoplatino a una temperatura establecida durante un tiempo determinado para producir un flujo de vapor. Para observar la muestra, incline la muestra de modo que el plano de la cuadrícula esté aproximadamente 10 grados desde el ángulo de incidencia del haz de iones, y mueva el centro de un cuadrado de cuadrícula adecuado para ser visto en las imágenes SEM y FIB.
usando el haz de iones a baja corriente, Examine la cuadrícula con un aumento alto para visualizar las celdas en el centro de un cuadrado de cuadrícula. Marque dos patrones rectangulares para fresar, uno por encima y otro por debajo de una región protegida de tres micrómetros de espesor. A continuación, elija la configuración del haz y corrija el astigmatismo ajustando el brillo y el contraste.
una vez completada la configuración, comience a fresar a una corriente de 300 picoamperios mientras monitorea el progreso en vivo en la vista del haz de iones e intermitentemente por SEM. La muestra se comprueba En la vista SEM, y después del primer fresado, Si el haz de iones no ha atravesado la muestra por encima y por debajo de la región protegida, elimine más material aumentando la altura de los patrones rectangulares. Detenga el fresado cuando la superficie por encima y por debajo de la lámina esté completamente lisa en la vista del haz de iones.
Repita el proceso de fresado paso a paso, reduciendo la corriente del haz de iones cada vez hasta alcanzar un espesor de 300 nanómetros. Registre la posición X Y Z de cada lámina. Para pulir las laminillas al final del experimento, utilice una descripción general de SEM de bajo aumento para seleccionar un grupo de láminas que se pulirán y marcar la raíz de pulido.
Una vez marcada la raíz de pulido, reduzca el espacio entre los dos patrones rectangulares a 100 a 200 nanómetros y comience el pulido a una corriente de haz de iones de 30 picoamperios. Monitoree el progreso por SEM a dos o tres kilovoltios. Deje de pulir cuando el contraste en la lámina se pierde por SEM o cuando la capa organoplatino o la propia lámina comienzan a perder integridad.
Adquiera y guarde imágenes SEM de bajo aumento de cada lámina. Después de completar el experimento, retire la lanzadera del microscopio. Retire las rejillas con laminillas y guárdelas bajo nitrógeno líquido.
Maneje las rejillas con cuidado. Para estudiar la morfología, los esquizontes se estancaron en diferentes etapas de salida utilizando el compuesto dos en inhibidores de E-64. En presencia del compuesto dos, el límite entre las membranas parasitóforas y la hemoglobina circundante en el glóbulo rojo del huésped estaba bien definido.
La vacuola parasitófora intacta, o PV, estaba llena de merozoítos en un solo grupo de cristales de hemozoína. Cuando el compuesto dos esquizontes sincronizados se lavó en E-64, la membrana fotovoltaica se rompió y los merozoítos se extendieron dentro del RBC. Un ejemplo típico de buena distribución celular en una rejilla de cobre muestra grandes glóbulos rojos con una periferia bien definida y una membrana vacuola intacta.
Dentro de un glóbulo rojo huésped parcialmente colapsado, los merozoítos individuales se visualizaron como grupos de células pequeñas. Cada esquizonte tenía una mancha negra en su centro que indicaba la posición de los cristales de hemozoína. Después del fresado, las rejillas se cargaron en el TEM para identificar las posiciones de las laminillas y encontrar áreas adecuadas para apuntar por tomografía.
En la micrografía de la muestra, se puede ver un RBC que recientemente había sido invadido por un merozoíto. El merozoíto rodeado por la membrana derivada de la célula huésped se podía ver dentro del límite del RBC. En el extremo apical del merozoíto, las dos membranas que rodean la célula y cuatro membranas apiladas en el vértice del merozoíto asociadas con una característica en forma de hongo densa en electrones eran claramente visibles.
Dentro del citoplasma del merozoíto, se identificó un evento de fusión entre la membrana plasmática del merozoíto y una vesícula multicapa. En un análisis TEM adicional de una lámina de 230 nanómetros de espesor, se observó la morfología típica de un merozoíto maduro tratado con E-64. Dentro de la membrana de los glóbulos rojos, la membrana plasmática del merozoíto se puede ver con orgánulos como el complejo de membrana interna, los anillos polares, los micronemes, las rhoptries y la envoltura nuclear.
La parte más importante de esta técnica es optimizar las rejillas para permitir la producción reproducible y eficiente de laminillas delgadas. El desarrollo adicional de esta técnica permitirá a los investigadores visualizar moléculas de una sola proteína dentro de los parásitos de la malaria y determinar su papel en la salida de la malaria.
