このプロトコルは、クライオ電子線トモグラフィーのための熱帯熱マラリア原虫感染赤血球の硝子体ラメラの調製について概説しています。これにより、寄生虫がどのようにマラリアを引き起こすかについての詳細な構造情報を直接観察することができます。クライオ電子線トモグラフィーは、細胞の内部に関する高解像度情報を記録します。
単一のタンパク質複合体をその場で観察するのに十分強力であり、計算的に抽出および平均化して、タンパク質に関する3次元構造情報を明らかにすることができます。このプロトコルは、さまざまな細胞タイプに簡単に適合させることができ、クライオ電子線トモグラフィー用の硝子体ラメラを作製する初心者の出発点となります。これは、今日プロトコルを実行するアレハンドラ・カルバハルです。
まず、CryoStageを使用して凍結した銅グリッドを光学顕微鏡用にスクリーニングし、グリッド全体の氷の勾配に特に注意を払います。個々のグリッドの正方形をチェックして、氷の薄い領域のセルカバレッジを確認します。黒い消えないマーカーを使用して、クライオ-FIB-SEM固有のオートグリッドリムの前面と反対側をマークします。
クリップしたグリッドをカーボン側を上にしてクライオ-FIB-SEMシャトルにロードし、厚さ4ナノメートルのカーボンまたはプラチナ電子ビーム回転コートをセルの表面に塗布します。シャトルをクライオ-FIB-SEMにロードし、SEMによって各グリッド上のセル分布を5キロボルトで評価します。100乗で低倍率の概要を把握して、グリッド全体の氷の勾配を確認します。
次に、5, 000の累乗で高倍率の画像を撮影して、個々のグリッドの正方形を確認します。ガス注入システムの針をグリッドの上のチャンバーに挿入し、有機白金源を設定温度に設定時間加熱して蒸気の流れを生成することにより、各グリッドの表面に2マイクロメートルの有機白金コートを塗布します。試料を観察するには、グリッドの平面がイオンビームの入射角から約10度になるように試料を傾け、SEM画像とFIB画像の両方で見られるように適切なグリッド正方形の中心を移動します。
低電流のイオンビームを使用して、グリッドを高倍率で調査し、グリッド正方形の中心にあるセルを視覚化します。厚さ3マイクロメートルの保護領域の上と下の2つの長方形パターンをフライス加工します。次に、ビーム設定を選択し、明るさとコントラストを調整して非点収差を修正します。
セットアップが完了したら、イオンビームビューでライブの進行状況を監視しながら、SEMで断続的に300ピコアンペアの電流でフライス加工を開始します。サンプルがチェックされます SEMビューで、最初のフライス加工後、イオンビームが保護領域の上下のサンプルを突破していない場合は、長方形のパターンの高さを増やして、より多くの材料を除去します。ラメラの上下の表面がイオンビームビューで完全に滑らかになったら、フライス加工を停止します。
フライス加工を段階的に繰り返し、300ナノメートルの厚さに達するまで毎回イオンビーム電流を減らします。各ラメラのXYZ位置を記録します。実験の最後にラメラを研磨するには、低倍率のSEM概要を使用して、研磨するラメラのグループを選択し、研磨ルートにマークを付けます。
研磨ルートにマークを付けたら、2つの長方形パターン間のスペースを100〜200ナノメートルに減らし、30ピコアンペアのイオンビーム電流で研磨を開始します。SEMで2〜3キロボルトで進行状況を監視します。ラメラのコントラストがSEMによって失われた場合、または有機プラチナコートまたはラメラ自体が完全性を失い始めた場合は、研磨を停止します。
各ラメラの低倍率SEM画像を取得して保存します。実験が完了したら、シャトルを顕微鏡から取り出します。ラメラでグリッドを取り外し、液体窒素の下に保管します。
グリッドの取り扱いには注意してください。形態を研究するために、シゾントはE-64阻害剤の化合物2を使用して、出口のさまざまな段階で失速しました。化合物2の存在下では、宿主赤血球中の寄生性膜と周囲のヘモグロビンとの間の境界が明確に定義されていた。
無傷の寄生液胞(PV)は、ヘモゾイン結晶の単一のクラスターにメロゾイトを詰めていました。化合物2つの同期シゾントをE-64に洗浄すると、PV膜が破裂し、メロゾイトが赤血球内に広がりました。銅グリッド上の良好な細胞分布の典型的な例は、明確に定義された周辺と無傷の液胞膜を有する大きな赤血球を示す。
部分的に崩壊した宿主赤血球内で、個々のメロゾイトを小細胞クラスターとして視覚化した。各シゾントの中心には、ヘモゾイン結晶の位置を示す黒い斑点がありました。フライス加工後、グリッドをTEMにロードして、ラメラの位置を特定し、断層撮影によってターゲットとするのに適した領域を見つけました。
サンプルの顕微鏡写真では、最近メロゾイトに侵入されたRBCを見ることができます。宿主細胞由来の膜に囲まれたメロゾイトは、赤血球の境界内に見られました。メロゾイトの頂端では、細胞を囲む2つの膜と、電子密度の高いキノコ形の特徴に関連するメロゾイトの頂点に積み重ねられた4つの膜がはっきりと見えました。
メロゾイトの細胞質内では、メロゾイト原形質膜と多層小胞との間の融合事象が同定された。厚さ230ナノメートルのラメラの追加のTEM分析では、E-64で処理された成熟メロゾイトの典型的な形態が観察されました。赤血球膜内では、メロゾイト原形質膜は、内膜複合体、極リング、ミクロネム、ロプトリー、核膜などの細胞小器官で見ることができます。
この技術の最も重要な部分は、薄いラメラの再現性のある効率的な生産を可能にするためにグリッドを最適化することです。この技術のさらなる開発により、研究者はマラリア原虫内の単一タンパク質分子を視覚化し、マラリアの排出におけるそれらの役割を決定することができます。
