В этом протоколе описывается подготовка стекловидных пластинок эритроцитов, инфицированных Plasmodium-falciparum, к криоэлектронной томографии. Это позволяет напрямую наблюдать подробную структурную информацию о том, как паразит вызывает малярию. Криоэлектронная томография записывает информацию высокого разрешения о внутренностях клеток.
Он достаточно мощный, чтобы наблюдать одиночные белковые комплексы in situ, которые могут быть извлечены и усреднены с помощью вычислений, чтобы выявить трехмерную структурную информацию о белках. Этот протокол может быть легко адаптирован для различных типов клеток и может стать отправной точкой для тех, кто плохо знаком с получением пластинок стекловидного тела для криоэлектронной томографии. Это Алехандра Карбаджал, которая сегодня будет выполнять протокол.
Для начала просейте замерзшие медные сетки с помощью CryoStage для светового микроскопа, уделяя особое внимание градиенту льда через сетку. Проверьте отдельные квадраты сетки на покрытие ячеек на более тонких участках льда. Используйте черный несмываемый маркер, чтобы отметить переднюю и противоположную стороны дисков Autogrid для Cryo-FIB-SEM.
Загрузите обрезанную сетку в челнок Cryo-FIB-SEM углеродной стороной вверх и нанесите на поверхность ячеек углеродное или платиновое вращающееся покрытие из углерода или платины толщиной четыре нанометра. Загрузите шаттл в Cryo-FIB-SEM и оцените распределение ячеек в каждой сетке с помощью SEM при пяти киловольтах. Сделайте обзор с малым увеличением при 100 мощности, чтобы посмотреть на градиенты льда по всей сетке.
Затем сделайте снимки с большим увеличением и мощностью 5 000, чтобы посмотреть на отдельные квадраты сетки. Нанесите двухмикрометровый платинорганический слой на поверхность каждой решетки, вставив иглу системы впрыска газа в камеру над решеткой и нагревая источник органоплатины до заданной температуры в течение заданного времени для получения потока пара. Чтобы наблюдать за образцом, наклоните образец так, чтобы плоскость сетки находилась примерно в 10 градусах от угла падения ионного пучка, и переместите центр подходящего квадрата сетки, который будет виден как на изображениях SEM, так и на изображениях FIB.
используя ионный пучок при малом токе, Обследуйте сетку с большим увеличением, чтобы визуализировать ячейки в центре квадрата сетки. Разметьте два прямоугольных узора для фрезерования, один над защищенной областью толщиной три микрометра, а другой под ней. Затем выберите настройки луча и исправьте астигматизм, отрегулировав яркость и контрастность.
после завершения настройки начните фрезерование при токе 300 пикоампер, отслеживая прогресс в реальном времени в виде ионного пучка и периодически с помощью SEM. Образец проверяется в виде SEM и после первого фрезерования, если ионный пучок не пробил образец выше и ниже защищенной области, удалите больше материала, увеличив высоту прямоугольных узоров. Прекратите фрезерование, когда поверхность над и под ламелью станет полностью гладкой в виде ионного пучка.
Повторяйте процесс фрезерования поэтапно, каждый раз уменьшая ток ионного пучка до тех пор, пока толщина не достигнет 300 нанометров. Запишите положение X Y Z каждой ламели. Чтобы отполировать ламели в конце эксперимента, используйте обзор SEM с малым увеличением, чтобы выбрать группу ламелей для полировки и отметить полировальный корень.
После того, как полировальный корень отмечен, уменьшите расстояние между двумя прямоугольными узорами до 100-200 нанометров и начните полировку при токе ионного пучка 30 пикоампер. Следите за прогрессом с помощью SEM при двух-трех киловольтах. Прекратите полировку, когда контраст в ламели теряется с помощью SEM или когда органоплатиновое покрытие или сама ламель начинает терять целостность.
Получайте и сохраняйте изображения SEM с малым увеличением каждой ламели. После завершения эксперимента извлеките челнок из микроскопа. Снимите сетки с ламелями и храните их под жидким азотом.
Обращайтесь с сетками осторожно. Для изучения морфологии шизонты были остановлены на разных стадиях выхода с использованием второго соединения в ингибиторах E-64. В присутствии второго соединения граница между паразитофорными мембранами и окружающим гемоглобином в эритроците хозяина была четко определена.
Интактная паразитофорная вакуоль, или PV, была заполнена мерозоитами в одном кластере кристаллов гемозоина. Когда соединение двух синхронизированных шизонтов было вымыто в E-64, PV-мембрана разорвалась, и мерозоиты распространились внутри эритроцитов. Типичным примером хорошего распределения клеток на медной сетке являются крупные эритроциты с четко очерченной периферией и неповрежденной мембраной вакуоли.
В частично разрушенных эритроцитах-хозяевах отдельные мерозоиты визуализировались в виде небольших клеточных кластеров. Каждый шизонт имел черное пятно в центре, указывающее на положение кристаллов гемозоина. После фрезерования сетки загружались в ПЭМ, чтобы определить положение ламелей и найти подходящие области для нацеливания с помощью томографии.
На микрофотографии образца можно увидеть эритроцит, который недавно был захвачен мерозоитом. Мерозоит, окруженный мембраной, полученной из клетки-хозяина, можно было увидеть в пределах границ эритроцитов. На апикальном конце мерозоита были хорошо видны две мембраны, окружающие клетку, и четыре мембраны, уложенные на вершине мерозоита, связанные с электронно-плотным грибовидным элементом.
В цитоплазме мерозоита было идентифицировано событие слияния между плазматической мембраной мерозоита и многослойной везикулой. В дополнительном ПЭМ-анализе ламели толщиной 230 нанометров наблюдалась типичная морфология зрелого мерозоита, обработанного Е-64. В мембране эритроцитов плазматическую мембрану мерозоита можно увидеть с органеллами, такими как комплекс внутренней мембраны, полярные кольца, микронемы, роптри и ядерная оболочка.
Наиболее важной частью этого метода является оптимизация сеток для обеспечения воспроизводимого и эффективного производства тонких ламелей. Дальнейшее развитие этого метода позволит исследователям визуализировать молекулы одного белка в малярийных паразитах и определить их роль в выходе малярии.
