هذا البروتوكول يمكن أي شخص من إجراء تجارب FRET جزيء واحد لقياس المسافات المطلقة دقيقة داخل الجزيئات الحيوية باستخدام smfBox، وهو رخيصة، قوية، أداة مفتوحة المصدر. smFRET يسمح لك أن ننظر إلى جزيء واحد في وقت واحد، بدلا من متوسط عدة مليارات من الجزيئات، بحيث يمكنك توصيف تشكيلات مختلفة التي تعتمدها. جمال هذه الطريقة هو أنه يمكن استخدامها لتسليط الضوء على هيكل وديناميات العديد من النظم الجزيئية الحيوية.
على سبيل المثال، طي البروتين، وتفاعلات الحمض النووي البروتيني، والتستوستيرون في الحمض النووي. قبل البدء في التحليل، قم بتشغيل مركز التحكم بالليزر وتأكد من تحديد الموجة المستمرة التي تتناوب الوضع الحالي الثابت. الطاقة على كل من الليزر.
تشغيل برنامج اقتناء smOTTER وتأكيد أن يتم تكوين كل أداة بشكل صحيح. لمحاذاة مسار الانبعاثات، ضع قطرة من زيت الغمر على الهدف ووضع زجاج غطاء نظيف بعناية على العدسة الهدف، وخفض في زاوية إلى النفط لمنع محاصرة فقاعات الهواء بين الزجاج الغطاء والهدف. ثم أضف 10 ميكرولتر من 100 صبغة Cy3B نانومولار على وسط الزجاج الغطاء.
في لوحة دورات الليزر واجب، تعيين الليزر المانحة إلى الصفر قبالة، 45 على، و 55 قبالة. تعيين ليزر مقبول إلى 50 قبالة، 45 على، وخمسة قبالة. تعيين الإثارة الليزر بالتناوب أو ALEX الفترة إلى 100 ميكروثانية.
افتح علامة التبويب التركيز Z. في لوحة الاستحواذ، قم بتبديل الليزر للعيش وبدء تشغيل الكاميرا. ضبط التعرض بحيث تظهر نقطة مضيئة محاطة مركزيا بخلفية سوداء.
بدءا من وضع Z منخفض، قم بزيادة الارتفاع حتى تصل النقطة المضيئة إلى الحد الأدنى من الحجم. ثم رفع الارتفاع إلى 20 ميكرومتر إضافية لتركيز الليزر في العينة فوق النفط والزجاج الغطاء. عندما تأتي العينة في التركيز، أوقف الكاميرا.
في مركز التحكم في omicron، قم بخفض طاقة الليزر الخضراء أثناء مراقبة مقياس المحور ص في علامة التبويب محاذاة smOTTER حتى تتم ملاحظة القراءة من كلا الكاشفين، وتغيير المقياس حسب الضرورة. ثم فك البراغي الأربعة في الجزء الأمامي من smfBox لإزالة اللوحة الأمامية. لمحاذاة الثقب، قم بتشغيل مقبض X على موضع الثقب أثناء مشاهدة الإشارة على علامة التبويب المحاذاة لزيادة الإشارة باللونين الأخضر والأحمر.
بدوره مقبض Y لمحاذاة الثقب في الاتجاه الآخر، ثم العودة إلى مقبض الباب X للتحقق من أي زيادة أخرى في إشارة. لمحاذاة عدسة الثقب، قم بتشغيل مقبض العدسة X في اتجاه واحد لتقليل الإشارة، ثم قم بتشغيل مقبض الباب X في نفس الاتجاه لإعادة الإشارة إلى المستوى الأصلي. إذا كانت إشارة الحد الأقصى الجديدة أعلى من ذي قبل ، استمر في تحريك كل من الثقب ومقابض العدسة في هذا الاتجاه.
إذا كانت الإشارة أقل من ذي قبل، حرك المقابض بشكل متكرر في الاتجاه المعاكس، ثم كرر المحاذاة باستخدام الثقب والمقابض Y العدسة. لمحاذاة عدسة الصمام الثنائي الضوئي الانهيار الجليدي، بدءا من الصمام الثنائي الضوئي الانهيار الجليدي الأخضر، تحريك مقبض X حتى الإشارة الخضراء في أقصى حد لها. كرر تعديل الإشارة للمقبض Y.
العودة إلى مقبض X، تتحرك ذهابا وإيابا للعثور على نقاط العتبة التي تبدأ إشارة في الانخفاض. اترك الإشارة في موضع في منتصف الطريق بين هاتين النقطتين. العثور على موقف منتصف الطريق لمقبض Y وتكرار المحاذاة للثنائي الجليدي الأحمر.
قبل تحليل العينة الأولى، قم بتنظيف المرحلة بأنسجة تنظيف العدسة المنقوعة بالميثانول، ومسح الهدف برفق من طرف إلى آخر وتطبيق ثلاث إلى أربع قطرات من زيت الغمر على مركز الهدف. إضافة 10 ميكرولترات من نوع واحد المياه فائقة الشراء إلى مركز الزجاج غطاء نظيف ورصد أثر المياه للتأكد من أنه لا لوحظ إشارات الفلورسنت. ثم استخدم ملاقط مطاطية لإزالة زجاج الغطاء بعناية وتجديد زيت الغمر إذا لزم الأمر.
لضمان الحصول على بيانات جزيء واحد، بعد تمييع العينة، حدد التركيز الذي لوحظ واحد إلى خمسة رشقات نارية في الثانية الواحدة في لوحة التتبع الحية. عندما يتم تحديد التركيز المناسب، اضغط على عازلات السيليكون قطرها ثمانية إلى تسعة ملليمترات على مركز زجاج غطاء جديد وإضافة بعناية 10 ميكرولتر من العينة إلى المركز، وتجنب الاتصال مع السيليكون. ضع زجاج الغطاء الثاني على المعزلات حتى يتم تشكيل الختم.
تحقق من قياس قياس الاستواء الحي مقابل الرسم البياني لكفاءة FRET لمراقبة ما إذا كانت العينة تتصرف كما هو متوقع. في لوحة حفظ الإعدادات، أدخل المعلومات الخاصة باسم العينة وتفاصيلها، وملصقات المانحين والمتقبلين، والأطوال الموجية للموجة العازلة، والأطوال الموجية للمتبرعين والمتقبلين، وأطوال الموجات الكشفية وقوة الليزر، والانتماء للمستخدم النهائي والمستخدم. في لوحة الاستحواذ، أدخل طول التجربة في دقائق وحدد فاصل حفظ مناسب للتخفيف من أي فقدان محتمل للبيانات في حالة حدوث خطأ.
حدد حفظ صلاحيات الليزر إذا لزم الأمر، ثم انقر فوق البدء لبدء الحصول على البيانات. في نتيجة إيجابية، سيتم الحصول على ما بين خمسة وانفجار واحد في الثانية الواحدة. في نتيجة سلبية، سيتم ملاحظة رشقات نارية كثيرة جدا أو قليلة جدا في نفس الإطار الزمني.
بعد جمع وتحليل، يجب أن تتطابق مؤامرة التناوب مع فترة ALEX من الإعداد التجريبي. ويستخدم أثر الوقت لتقييم نوعيا أن تركيز العينة معقول. تظهر مؤامرة الخلفية توزيع فترات التأخير بين فوتونات مع تناسب خطي إلى فترات أطول لتقدير معدل الخلفية.
يمكن استخدام تتبع الخلفية لتحديد ما إذا كانت هناك تغييرات في العينة خلال مدة التجربة. يتم إنشاء مخططات تخطيطية كفاءة Stoichiometry مقابل FRET ، واختيار لجميع الأنواع والأنواع ذات العلامات المتناسقة. يتم إنشاء مخطط بياني كفاءة FRET 1D مع تركيب الغاوسية للبيانات.
لذا فإن تركيز العينة هنا هو المفتاح. إذا كان مرتفعا جدا ، فأنت لا تقوم بتجربة جزيء واحد بعد الآن ، في حين أنه إذا كان منخفضا جدا ، فسيستغرق الأمر وقتا طويلا للحصول على البيانات. لقد مكن من تحديد هياكل الجزيئات الحيوية الديناميكية ، والتي لا يمكن تحديدها بطرق أخرى مثل NMR أو علم البلورات.
