مرحبا، في هذا الفيديو سوف نعرض لكم كيفية استكشاف m6A و m5C epitranscriptomes على العدوى الفيروسية. لبدء التجربة، ستحتاج إلى 50 مليون خلية لغير المصابين و 50 مليون للحالة المصابة. من أجل الحصول على مجموعة بيانات عالية الجودة عند التحليل ، ستحتاج إلى تحقيق عدوى عالمية.
هنا نصيب هذه الخلايا بناقل قائم على فيروس نقص المناعة البشرية ونقوم بقياس GFP المشفرة بشكل فيروسي من قبل FACS. في هذه الحالة، كان لدينا 80٪ من الخلايا المصابة وشرع مع سير العمل بدءا من استخراج الحمض النووي الريبي الكلي. لذلك قسمنا الخلايا في الاقتباسات من 10 مليون لكل منهما وليز لهم في 1 مل من تريزول.
ثم أضفنا 200 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى lysate الخلية ومختلطة عن طريق الانعكاس. عند هذه النقطة، تركنا lysate الجلوس لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة ومن ثم الطرد المركزي جميع العينات بسرعة عالية لمدة 15 دقيقة في أربع درجات. تتوقع أن ترى فصل المرحلة في ثلاث مراحل مختلفة، كما هو مبين هنا.
يجلس الحمض النووي الريبي في المرحلة العليا ، لذلك قم بنقل المرحلة المائية بعناية إلى أنبوب جديد عن طريق الانتباه إلى عدم نقل الطبقة العضوية. عند هذه النقطة، إضافة 0.5 مل من ايزوبروبانول إلى المرحلة المائية وتخلط بعناية عن طريق عكس. ويمكن بعد ذلك احتضان العينات ساعة واحدة في 80 درجة لضمان هطول الأمطار الحمض النووي الريبي.
عند الطرد المركزي بسرعة عالية، يجب أن تكون قادرة على رؤية بيليه الجيش الملكي النيبالي لطيفة كما هو مبين هنا. تجاهل بعناية supernatant إما عن طريق الانعكاس أو عن طريق pipetting، مع إيلاء الاهتمام في عدم تعطيل بيليه. ثم غسل بيليه الحمض النووي الريبي مع مل واحد من الإيثانول الصف الجزيئي 75٪.
ودوامة العينة لفترة وجيزة. عند الطرد المركزي، تأكد من استرداد بيليه الحمض النووي الريبي الأبيض لطيفة. تخلص من المادة الفائقة واترك حبيبات الحمض النووي الريبي تجف لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
Resuspend كل بيليه في 20 ميكرولتر من الماء وتجمع كل عينة من نفس الحالة معا. مجموع الجيش الملكي النيبالي الآن على استعداد لعزل ميرنا عن طريق اختيار بولي-A. لكل عينة من 75 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي، وإعداد 200 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي Oligo-DT وغسلها في مل واحد من العازلة ملزمة.
ضع الأنبوب على حامل مغناطيسي واسمح للخرزات بالارتباط بالمغناطيس أثناء مزيج واحد. تخلص من المادة الزائدة وكرر الإجراء لغسله مرة ثانية. ثم إزالة الخرز من المدرجات المغناطيسية وإعادة إنفاقها بعناية في 100 ميكرولتر من العازلة ملزمة.
عند هذه النقطة، وإعداد عينة الجيش الملكي النيبالي بقسمتها على 75 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي لكل aliquot إعادة إنفاقها في 100 ميكرولتر من الماء. إضافة 100 ميكرولتر من العازلة ملزمة واحتضان لمدة دقيقتين في 65 درجة. ثم تدور أسفل العينات واحتضان على الجليد.
أضف بعد ذلك 100 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المغسول إلى كل عينة من عينات الحمض النووي الريبي واترك الربط على عجلة دوارة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. عند الحضانة، ضع الأنبوب مرة أخرى في رف مغناطيسي والسماح لهم باحتضان لمدة دقيقة واحدة. ثم استرجع المادة الفائقة في أنبوب جديد واحتفظ بها جانبا لجولة ثانية من العزلة.
غسل الخرز مرتين مع 200 ميكرولتر من العازلة الغسيل ومن ثم المضي قدما إلى elution. من أجل elute بولي ألف الحمض النووي الريبي مختارة من الخرز المغناطيسي، إضافة 20 ميكرولتر من الجليد الباردة TRIS HCl إلى كل عينة وماصة بعناية. ثم احتضان العينات الخاصة بك في 80 درجة لمدة دقيقتين للافراج عن الحمض النووي الريبي من الخرز.
انقل الحمض النووي الريبي الفائق الذي يحتوي على الحمض النووي الريبي المختار من البولي A إلى أنبوب جديد ، مع توخي الحذر في تجنب ترحيل الخرز. يجب تكرار خطوة الحذف وكذلك خطوة العزل مرتين من أجل زيادة إنتاجية الحمض النووي الريبوزي المرسال. أصبح mRNA جاهزا الآن إما لإدخال خط أنابيب meRIP-Seq في خطوة التجزئة أو الانتقال مباشرة إلى تحويل bisulfite.
الخطوة الأولى لدخول خط أنابيب meRIP-Seq تتكون من تجزئة مرنا. لهذا ، تحتاج إلى خمسة ميكروغرام من mRNA مقسمة إلى أليكوت من 18 ميكرولتر في أنابيب 0.2 مل. ولضمان اتساق البيانات، من المهم العمل بسرعة وبقلة عينة فقط في ذلك الوقت.
لهذه التجربة، تم تحسين التجزؤ من أجل الحصول على جزء من حجم بين 115 و 200 نيوكليوتيدات. ثم أضف اثنين من ميكرولتر من كاشف التجزئة إلى كل أنبوب يحتوي على 18 ميكرولتر من مرنا توخي الحذر في إيداع قطرة على جدار الأنبوب. قم بتدريج جميع العينات من أجل السماح بالاتصال بين الكاشف والجيش الملكي النيبالي في نفس الوقت واحتضانه عند 70 درجة لمدة 15 دقيقة.
بمجرد انتهاء الحضانة ، أوقف التفاعل بإضافة اثنين من الميكرويتر من 0.5 M EDTA. عند هذه النقطة، يمكنك تنقية مرنا مجزأة الخاص بك مع الطريقة التي تختارها والمضي قدما إلى مراقبة الجودة الجيش الملكي النيبالي من قبل محلل جزء. هذه الخطوة اختيارية ، ولكنها ستسمح بتقييم حجم الجزء قبل إشراك هطول الحمض النووي الريبي.
كما ترون هنا في الممر الرابع، نحصل على كل من جزء العينة لدينا من حوالي 150 نيوكليوتيد لكل منهما. ثم شرعنا مع meRIP- Seq. وتتكون الخطوة الأولى في زوجين A / G الخرز المغناطيسي مع الأجسام المضادة لل M6A أو الضوابط IgG.
لكل خطة رد فعل، نقل 25 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي إلى أنبوب جديد. يرجى ملاحظة أنك ستحتاج إلى حالة واحدة على الأقل خاصة ب m6A وحالة تحكم واحدة. اغسل كل 25 ميكرولتر من الخرز مع 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت IP.
أعد تعليق الخرز بلطف عن طريق السحب لأعلى ولأسفل وضع الأنبوب على الرف المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة للسماح بفصل الخرز. قم بإزالة وتخلص من supernatant ، مع الانتباه إلى عدم شفط الخرز المغناطيسي وكرر خطوة الغسيل مرة واحدة. ثم أعد تعليق الخرز المغناطيسي في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت IP لكل 25 ميكرولتر من الحجم الأصلي للخرز.
قم بإعداد وتسمية أنبوب واحد لكل حالة. في حالتنا، سيكون لدينا أنبوبين للحالة المصابة، واحد ل M6A وواحد للسيطرة على IgG، وأنابيب اثنين للحالة غير المصابة. ثم أضف 100 ميكرولتر من الخرز المغسول في كل أنبوب.
الخرز جاهزة الآن لتكون مقترنة بأجسام مضادة محددة أو ضوابط IgG. إضافة خمسة ميكروغرام من الأجسام المضادة لل m6A محددة أو المضادة للسيطرة على IgG الأجسام المضادة لكل أنبوب يحتوي على 100 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي غسلها. السماح للأجسام المضادة حبات اقتران عن طريق احتضان أنبوب 30 دقيقة على عجلة دوارة.
وفي الوقت نفسه ، تابع إعداد العينة. لكل حالة مخطط لها، إما خاصة ب m6A أو التحكم في IgG، ستكون مادة البدء الخاصة بك 2.5 ميكروغرام من الحمض النووي الريبوزي المرسال المجزأ المعاد تعليقه 100 ميكرولتر من الماء. للحصول على حجم تفاعل نهائي قدره 500 ميكرولتر، أضف 295 ميكرولتر من الماء إلى كل عينة.
أضف بعد ذلك خمسة ميكرولتر من مثبط RNAase تتركز في 40 وحدة لكل ميكرولتر بمبلغ إجمالي قدره 200 وحدة لكل عينة وتخلط بلطف. وأخيرا إضافة 100 ميكرولتر من 5X مركزة IP العازلة لكل أنبوب. العينات جاهزة الآن لرد فعل هطول الأمطار المناعي.
استرجع الخرز المغناطيسي إلى جانب الأجسام المضادة من العجلة الدوارة وقم بتدويرها لأسفل. أضف بعد ذلك 500 ميكرولتر من العينات المعدة مسبقا إلى كل 100 ميكرولتر من الخرز إلى جانب الأجسام المضادة المحددة. اخلطي بلطف عن طريق السحب لأعلى ولأسفل عدة مرات لإعادة تعليق الخرز بالكامل.
احتضنها أو تفاعل meRIP الخاص بك على عجلة دوارة عند أربع درجات خلال ساعتين. بمجرد انتهاء الحضانة ، قم بتدير كل أنبوب ووضعها على رف مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة للسماح بفصل الخرز. ثم قم بإزالة الكسر غير المنضم ووضعه على أنبوب جديد والاحتفاظ به لمزيد من التحليل، إذا لزم الأمر.
قم بإزالة المغناطيس من الحامل وأعد تعليق جميع العينات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت IP. إعادة إنفاق كل عينة بعناية عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. أدخل المغناطيس على الرف، واحتضان لمدة دقيقة واحدة، ومن ثم إزالة بعناية supernatant.
كرر الغسيل مرتين، ثم انتقل مع الغبطة. لكل عينة، M6A محددة والتحكم، وإعداد 225 ميكرولتر من العازلة elution تحتوي على 20 ملليمولار من m6A النقي. ثم أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت elution لكل عينة.
احتضان كل عينة ساعة واحدة في أربع درجات على الروك. ثم جمع كل M6A المخصب عينة الجيش الملكي النيبالي في أنبوب جديد والمضي قدما في جولة ثانية من elution. تنقية RNA المخصب M6A مع الطريقة التي تختارها ومن ثم في هذه المرحلة عينات جاهزة لإعداد المكتبة والتسلسل.
للتحقيق في تعديل m5C ، نستخدم تحويل bisulfite. بدء التجربة مع 500 نانوغرام من الحمض النووي الريبي متعدد adenylated. على الرغم من اختياري، إضافة إلى عينة الخاص بك 500 picogram من الحمض النووي الريبي البولي-A المنضب لضمان تمثيل ريبوسومي و 0.5 ميكرولتر من تسلسل الاصطناعية المتاحة تجاريا سوف تسمح لك لتقييم معدل تحويل بيسلفيت عند التسلسل.
ضبط العينة الخاصة بك إلى حجم النهائي من 20 ميكرولتر في الماء، ومن ثم إضافة 130 ميكرولتر من كاشف تحويل الحمض النووي الريبي إلى كل عينة. اخلطي بعناية عن طريق السحب لأعلى ولأسفل وقلبي كل العينة للتأكد من عدم وجود قطرات متبقية على جانب الأنابيب. احتضان جميع العينات في جهاز PCR لثلاث دورات من تمسخ 70 درجة لمدة خمس دقائق وتحويل bisulfite عند 54 درجة خلال 45 دقيقة.
قم بإجراء إزالة الأمين داخل العمود عن طريق الإضافة مباشرة على عمود فارغ ، 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت لربط الحمض النووي الريبي ، 150 ميكرولتر من عينة bisulfite المحولة. امزج العينة عن طريق السحب لأعلى ولأسفل ، ولكن مع الانتباه إلى عدم لمس مرشحات العمود. أضف 400 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 95-100٪ إلى خليط المخزن المؤقت لربط الحمض النووي الريبي مباشرة في العمود.
إغلاق الغطاء وتخلط على الفور عن طريق عكس. قم بتدير العينة لمدة 30 ثانية وتجاهل التدفق. اغسل عمودك بحاجز الغسيل ثم أضف 200 ميكرولتر من محلول إزالة الشفط إلى وسط كل عمود.
احتضان كل ما تبذلونه من العينة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بتدسير العينة لمدة 30 ثانية ثم تابع جولتين من الغسيل. إضافة 400 ميكرولتر من العازلة غسل لكل عينة، والطرد المركزي لمدة 30 ثانية بأقصى سرعة وتجاهل تدفق من خلال.
ضع العمود في أنبوب فارغ جديد وeee البيسوليت تحويل الحمض النووي الريبي إلى 20 ميكرولتر من الماء. التحكم في كفاءة تحويل البيسوليت بواسطة RT-qPCR ثم الانتقال إلى إعداد المكتبة وتسلسلها. بناء على التحليل المعلوماتي الحيوي، إليك بعض الأمثلة على النتائج التي قد تحصل عليها مع سير العمل هذا.
هنا نقارن epitranscriptome من الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية مقابل الخلايا غير المصابة. في 24 ساعة بعد الإصابة. في لوحة A، يمكنك أن ترى النتائج التي نحصل عليها استكشاف epitranscriptome m6A.
في هذا الرسم البياني، نرسم القراءات المخصبة m6A بناء على تحليل meRIP-Seq. يمكننا أن نرى بشكل جيد إصبع الزنك مفرط الميثيل بعد 24 ساعة من الإصابة. أجرينا نفس النوع من التحليل للتحقيق في m5C epitranscriptome في لوحة B.In هذا الرسم البياني ، يتم عرض كل سيتوزين غير ميثيل باللون الأحمر ، في حين تظهر نسبة السيتوزين الذي تم ميثيل m5C باللون الأزرق.
كما ترون، PHLPP1، جميع السيتوستينات الثلاثة التي هي فرط الميثيل 24 ساعة بعد الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية. وعموما، يسمح سير العمل هذا بالتحقيق في كل من M6A و m5C epitranscriptome من الخلايا المصابة ويمكن تطبيقه على هذا النحو على الجسيمات الفيروسية أيضا. فهم العدوى الفيروسية قادرة على تعديل المشهد epitranscriptomic المضيف سوف تعطينا الوصول إلى طبقة جديدة من التنظيم.
إن التحقيق في النصوص المثيلية التفاضلية عند العدوى الفيروسية سيوفر بالطبع موردا قيما للتدخل العلاجي الجديد. في الرابط أدناه يمكنك العثور على مواردنا الوصول المفتوح للتحقيق في نسخة الميثيل التفاضلية على عدوى فيروس نقص المناعة البشرية مع مرور الوقت.
