Привет, в этом видео мы покажем вам, как исследовать эпитранскриптомы m6A и m5C при вирусной инфекции. Чтобы начать эксперимент, вам понадобится 50 миллионов клеток для неинфицированных и 50 миллионов для инфицированного состояния. Чтобы получить высококачественный набор данных при анализе, вам нужно будет достичь универсальной инфекции.
Здесь мы заражаем эти клетки вектором на основе ВИЧ и измеряем вирусно закодированный GFP FACS. В этом случае у нас было 80% инфицированных клеток и мы продолжили рабочий процесс, начиная с полной экстракции РНК. Поэтому мы разделили клетки на аликвоты по 10 миллионов каждая и лизировали их в 1 мл тризола.
Затем мы добавили 200 микролитров хлороформа в клеточный лизат и смешали путем инверсии. В этот момент мы даем лизату постоять в течение трех минут при комнатной температуре, а затем центрифугируем все образцы на высокой скорости в течение 15 минут при четырех градусах. Вы ожидаете увидеть разделение фаз на три разные фазы, как показано здесь.
РНК находится в верхней фазе, поэтому осторожно переносите водную фазу в свежую трубку, обращая внимание на то, чтобы не переносить органический слой. В этот момент добавьте 0,5 мл изопропанола в водную фазу и тщательно перемешайте путем инверсии. Затем образцы могут быть инкубированы в течение одного часа при 80 градусах, чтобы обеспечить осаждение РНК.
При центрифугировании на высокой скорости вы должны быть в состоянии увидеть хорошую гранулу РНК, как показано здесь. Осторожно выбрасывайте супернатант либо путем инверсии, либо путем пипетки, обращая внимание на то, чтобы не нарушить гранулу. Затем промыть гранулу РНК одним мл 75% этанола молекулярного класса.
И вихрь образца ненадолго. После центрифугирования убедитесь, что вы извлекли хорошую белую гранулу РНК. Выбросьте супернатант и дайте грануле РНК высохнуть в течение 15 минут при комнатной температуре.
Повторно суспендируйте каждую гранулу в 20 микролитров воды и объедините все образцы из одного и того же состояния вместе. Полная РНК теперь готова к выделению мРНК путем поли-А отбора. Для каждого образца 75 мкг РНК готовят 200 микролитр магнитных шариков олиго-ДТ и промывают их в одном мл связывающего буфера.
Поместите трубку на магнитную подставку и позвольте шарикам связываться с магнитом во время одной смеси. Выбросьте супернатант и повторите процедуру для повторной стирки. Затем снимите бусины с магнитных подставок и аккуратно повторно суспендируйте их в 100 микролитрах связывающего буфера.
В этот момент подготовьте образец РНК, разделив его на 75 мкг РНК на аликвоту, повторно суспендированную в 100 микролитрах воды. Добавьте 100 микролитров связывающего буфера и инкубируйте в течение двух минут при 65 градусах. Затем раскрутите образцы и высиживайте на льду.
Затем добавьте 100 микролитров промытых магнитных шариков к каждому образцу РНК и обеспечьте связывание на вращающемся колесе в течение 15 минут при комнатной температуре. После инкубации поместите трубку обратно в магнитную стойку и дайте им высиживаться в течение одной минуты. Затем извлеките супернатант в свежую трубку и отложите его в сторону для второго раунда изоляции.
Дважды вымойте бусины 200 микролитром промывочного буфера, а затем приступайте к элюированию. Чтобы элюировать выбранную поли-А РНК из магнитных шариков, добавьте 20 микролитров ледяного TRIS HCl к каждому образцу и пипетке осторожно. Затем инкубируйте образцы при 80 градусах в течение двух минут, чтобы освободить РНК из шариков.
Переносите супернатант, содержащий поли-А выбранную РНК, в свежую трубку, стараясь избегать переноса шариков. Стадию элюирования, а также стадию выделения следует повторить дважды, чтобы увеличить выход мРНК. МРНК теперь готова либо войти в трубопровод meRIP-Seq на стадии фрагментации, либо перейти непосредственно к конверсии бисульфита.
Первый шаг для входа в трубопровод meRIP-Seq заключается в фрагментации мРНК. Для этого нужно пять микрограммов мРНК, разделенных на аликвоты по 18 микролитров в пробирках по 0,2 мл. Чтобы обеспечить согласованность данных, крайне важно работать быстро и с небольшим количеством выборки в то время.
Для этого эксперимента фрагментация была оптимизирована с целью получения фрагмента размером от 115 до 200 нуклеотидов. Затем добавьте два микролитра фрагментационного реагента в каждую трубку, содержащую 18 микролитр мРНК, осторожно откладывая каплю на стенку трубки. Раскрутите все образцы, чтобы обеспечить контакт между реагентом и РНК одновременно, и инкубируйте при 70 градусах в течение 15 минут.
Как только инкубация закончится, остановите реакцию, добавив два микролитра по 0,5 М ЭДТА. На этом этапе вы можете очистить фрагментированную мРНК с помощью выбранного вами метода и перейти к контролю качества РНК с помощью анализатора фрагментов. Этот шаг является необязательным, но он позволит оценить размер фрагмента до начала осаждения РНК.
Как вы можете видеть здесь, на четвертой полосе, мы получаем для обоих наших образцов фрагмент около 150 нуклеотидов каждый. Затем мы перешли к meRIP-Seq. Первый шаг состоит в паре магнитных шариков A / G с антителами против m6A или контролем IgG.
Для каждого плана реакции переложите 25 микролитр магнитных шариков в свежую трубку. Обратите внимание, что вам понадобится по крайней мере одно условие, специфичное для m6A, и одно контрольное условие. Вымойте каждые 25 микролитр бусин с 250 микролитрами IP-буфера.
Аккуратно повторно суспендируйте бусины, пипеткой вверх и вниз, и поместите трубку на магнитную стойку на одну минуту, чтобы обеспечить разделение бусин. Снимите и выбросьте супернатант, обращая внимание на то, чтобы не аспирировать магнитные шарики, и повторите этап стирки один раз. Затем повторно суспендируйте магнитные шарики в 100 микролитрах IP-буфера на каждые 25 микролитр исходного объема бусин.
Подготовьте и пометьте по одной трубке для каждого состояния. В нашем случае у нас будет две трубки для инфицированного состояния, одна для m6A и одна для контроля IgG, и две трубки для незараженного состояния. Затем добавьте в каждый тюбик по 100 микролитров вымытых шариков.
Бусины теперь готовы к сочетанию со специфическими антителами или контролем IgG. Добавьте пять микрограммов либо специфического антитела против m6A, либо контрольного антитела против IgG в каждую трубку, содержащую 100 микролитр промытых магнитных шариков. Допускают конъюгацию антитело-шарики путем инкубации трубки 30 минут на вращающемся колесе.
Тем временем приступайте к пробоподготовке. Для каждого запланированного состояния, специфичного для m6A или контроля IgG, ваш исходный материал будет представлять собой 2,5 микрограмм фрагментированной мРНК, ресуспендированной 100 микролитр воды. Чтобы конечный объем реакции составлял 500 микролитров, добавьте 295 микролитров воды в каждый образец.
Затем добавьте пять микролитров ингибитора РНКАазы, сконцентрированных по 40 единиц на микролитр, в общей сложности 200 единиц на образец и аккуратно перемешайте. Наконец, добавьте 100 микролитров 5X концентрированного IP-буфера в каждую трубку. Образцы теперь готовы к реакции иммунного осаждения.
Извлеките магнитные шарики в сочетании с антителами из вращающегося колеса и раскрутите их вниз. Добавляют затем 500 микролитров предварительно подготовленных образцов на каждые 100 микролитр бусин в сочетании со специфическими антителами. Аккуратно перемешайте, несколько раз пипеткой вверх и вниз, чтобы полностью повторно суспендировать бусины.
Инкубируйте их или вашу реакцию meRIP на вращающемся колесе при четырех градусах в течение двух часов. Как только инкубация закончится, раскрутите каждую трубку и поместите ее на магнитную стойку на одну минуту, чтобы обеспечить разделение шариков. Затем удалите несвязанную фракцию и поместите ее на свежую трубку и сохраните для дальнейшего анализа, если это необходимо.
Извлеките магнит из стойки и повторно суспендируйте все образцы в 500 микролитрах IP-буфера. Тщательно повторно суспендируйте каждый образец, пипетируя вверх и вниз. Вставьте магнит на стойку, высиживайте в течение одной минуты, а затем аккуратно удалите супернатант.
Повторите стирку дважды, а затем приступайте к элюированию. Для каждой пары образцов, специфичных для m6A и контрольных, готовят 225 микролитр буфера элюирования, содержащего 20 миллимоляров очищенного m6A. Затем добавьте 100 микролитр буфера элюирования на образец.
Инкубируйте все образцы один час при четырех градусах на коромысле. Затем соберите весь обогащенный m6A образец РНК в свежей пробирке и приступайте ко второму раунду элюирования. Очистите обогащенную m6A РНК с помощью выбранного вами метода И тогда на этом этапе образцы готовы к подготовке библиотеки и секвенированию.
Для исследования модификации m5C мы используем конверсию бисульфита. Начните эксперимент с 500 нанограммов полиаденилированной РНК. Хотя это необязательно, добавление к вашему образцу 500 пикограмм поли-А обедненной РНК для обеспечения рибосомного представления и 0,5 микролитра коммерчески доступной синтетической последовательности позволит вам оценить скорость превращения бисульфита при секвенировании.
Отрегулируйте образец до конечного объема в 20 микролитров в воде, а затем добавьте 130 микролитров реагента преобразования РНК к каждому образцу. Тщательно перемешайте, пипетируя вверх и вниз и вращая вниз весь образец, чтобы убедиться, что на боковой стороне пробирок не осталось капель. Инкубируйте весь образец в машине ПЦР в течение трех циклов денатурации 70 градусов в течение пяти минут и превращения бисульфита при 54 градусах в течение 45 минут.
Выполните дезаминирование в колонке, добавив непосредственно на пустую колонку 250 микролитр буфера связывания РНК, 150 микролитров вашего образца, преобразованного в бисульфит. Перемешайте образец, пипетируя вверх и вниз, но обращая внимание на то, чтобы не касаться фильтров столбцов. Добавьте 400 микролитров 95-100% этанола в образец буферной смеси, связывающей РНК, непосредственно в колонке.
Закройте колпачок и сразу же перемешайте путем инверсии. Раскрутите образец в течение 30 секунд и отбросьте сквозной поток. Вымойте колонку с помощью промывочного буфера, а затем добавьте 200 микролитров раствора для десульфирования в центр каждой колонки.
Инкубируйте весь образец в течение 30 минут при комнатной температуре. Открутите образец в течение 30 секунд, а затем приступайте к двум раундам промывки. Добавьте 400 микролитров промывочного буфера к каждому образцу, центрифугируйте в течение 30 секунд на полной скорости и отбросьте поток.
Поместите колонку в новую пустую трубку и элюируйте бисульфитную преобразованную РНК в 20 микролитра воды. Контролируйте эффективность конверсии бисульфитов с помощью RT-qPCR, а затем переходите к подготовке и секвенированию библиотеки. После биоинформационного анализа вот некоторые примеры результатов, которые вы можете получить с помощью этого рабочего процесса.
Здесь мы сравниваем эпитранскриптом ВИЧ-инфицированных клеток с неинфицированными клетками. через 24 часа после заражения. На панели A вы можете увидеть результаты, которые мы получаем, исследуя эпитранскриптом m6A.
На этом графике мы строим обогащенные m6A чтения при анализе meRIP-Seq. Мы можем хорошо видеть, что цинковый палец гиперметилирован через 24 часа после заражения. Мы провели тот же тип анализа для исследования эпитранскриптома m5C в панельных B.In этом графике каждый неметилированный цитозин отображается красным цветом, в то время как доля цитозина, который был метилирован m5C, показана синим цветом.
Как вы можете видеть, PHLPP1, все три цитозина, которые являются гиперметилированными 24-часовой пост-ВИЧ-инфекцией. В целом, этот рабочий процесс позволяет исследовать как эпитранскриптом M6A, так и m5C инфицированных клеток и может быть применен как таковой к вирусным частицам. Понимание вирусной инфекции, способной модифицировать эпитранскриптомный ландшафт хозяина, даст нам доступ к новому слою регуляции.
Исследование дифференциальных метилированных транскриптов при вирусной инфекции, конечно, обеспечит ценный ресурс для нового терапевтического вмешательства. По ссылке ниже вы можете найти наш ресурс открытого доступа для исследования дифференциального метилированного транскрипта при ВИЧ-инфекции с течением времени.
