Ciao, in questo video ti mostreremo come esplorare gli epitrascrittomi m6A e m5C sull'infezione virale. Per iniziare l'esperimento, avrai bisogno di 50 milioni di cellule per i non infetti e 50 milioni per la condizione infetta. Per ottenere un set di dati di alta qualità al momento dell'analisi, è necessario ottenere un'infezione universale.
Qui infettiamo queste cellule con un vettore basato sull'HIV e misuriamo la GFP codificata viralmente da FACS. In questo caso, abbiamo avuto l'80% delle cellule infette e abbiamo proceduto con il flusso di lavoro iniziando con l'estrazione totale dell'RNA. Quindi abbiamo diviso le cellule in aliquote di 10 milioni ciascuna e le abbiamo lisate in 1 ml di Trizol.
Abbiamo quindi aggiunto 200 microlitro di cloroformio al lisato cellulare e miscelato per inversione. A questo punto, lasciamo riposare il lisato per tre minuti a temperatura ambiente e poi centrifughiamo tutti i campioni ad alta velocità per 15 minuti a quattro gradi. Ti aspetteresti di vedere una separazione di fase in tre diverse fasi, come mostrato qui.
L'RNA è seduto nella fase superiore, quindi trasferisci con cura la fase acquosa in un tubo fresco prestando attenzione a non trasferire lo strato organico. A questo punto, aggiungere 0,5 ml di isopropanolo alla fase acquosa e mescolare accuratamente per inversione. I campioni possono quindi essere incubati un'ora a 80 gradi per garantire la precipitazione dell'RNA.
Dopo la centrifugazione ad alta velocità, dovresti essere in grado di vedere un bel pellet di RNA come mostrato qui. Scartare con attenzione il surnatante per inversione o per pipettaggio, prestando attenzione a non interrompere il pellet. Quindi lavare il pellet di RNA con un mL di etanolo di grado molecolare al 75%.
E vortice il campione brevemente. Dopo la centrifugazione, assicurati di recuperare un bel pellet di RNA bianco. Scartare il surnatante e lasciare asciugare il pellet di RNA per 15 minuti a temperatura ambiente.
Risospesare ogni pellet in 20 microlitri d'acqua e raggruppare tutti i campioni della stessa condizione insieme. L'RNA totale è ora pronto per l'isolamento dell'mRNA mediante selezione poly-A. Per ogni campione di 75 microgrammi di RNA, preparare 200 microlitri di perle magnetiche oligo-DT e lavarle in un mL di tampone legante.
Posizionare il tubo su un supporto magnetico e lasciare che le perline si leghino al magnete durante una miscela. Scartare il surnatante e ripetere la procedura per un secondo lavaggio. Quindi rimuovere le perline dai supporti magnetici e risospenderle con cura in 100 microlitro di tampone legante.
A questo punto, preparare il campione di RNA dividendoli in 75 microgrammi di RNA per aliquota risospesa in 100 microlitro di acqua. Aggiungere 100 microlitro di tampone legante e incubare per due minuti a 65 gradi. Quindi girare verso il basso i campioni e incubare sul ghiaccio.
Aggiungere quindi 100 microlitro di perline magnetiche lavate a ciascun campione di RNA e lasciare legare su una ruota rotante per 15 minuti a temperatura ambiente. Al momento dell'incubazione, riposizionare il tubo in un rack magnetico e lasciarli incubare per un minuto. Quindi recuperare il surnatante in un tubo fresco e tenerlo da parte per un secondo ciclo di isolamento.
Lavare le perline due volte con 200 microlitri di tampone di lavaggio e quindi procedere all'eluizione. Per eluire l'RNA selezionato poli-A dalle perle magnetiche, aggiungere con attenzione 20 microlitro di TRIS HCl ghiacciato a ciascun campione e pipetta. Quindi incubare i campioni a 80 gradi per due minuti per rilasciare l'RNA dalle perline.
Trasferire il surnatante contenente RNA selezionato poli-A in un tubo fresco, facendo attenzione ad evitare il riporto di perline. La fase di eluizione e la fase di isolamento devono essere ripetute due volte per aumentare la resa dell'mRNA. L'mRNA è ora pronto per entrare nella pipeline meRIP-Seq nella fase di frammentazione o per passare direttamente alla conversione del bisolfito.
Il primo passo per entrare nella pipeline meRIP-Seq consiste nella frammentazione dell'mRNA. Per questo, sono necessari cinque microgrammi di mRNA divisi in aliquote di 18 microlitri in tubi da 0,2 ml. Al fine di garantire dati coerenti, è fondamentale lavorare rapidamente e con solo pochi campioni al momento.
Per questo esperimento, la frammentazione è stata ottimizzata al fine di ottenere frammenti di dimensioni comprese tra 115 e 200 nucleotidi. Quindi aggiungere due microlitri di reagente di frammentazione a ciascun tubo contenente 18 microlitri di mRNA facendo attenzione a depositare la goccia sulla parete del tubo. Ruotare tutti i campioni per consentire il contatto tra il reagente e l'RNA allo stesso tempo e incubare a 70 gradi per 15 minuti.
Una volta terminata l'incubazione, interrompere la reazione aggiungendo due microlitri di 0,5 M EDTA. A questo punto, è possibile purificare l'mRNA frammentato con il metodo scelto e procedere a un controllo di qualità dell'RNA tramite analizzatore di frammenti. Questo passaggio è facoltativo, ma consentirà di valutare la dimensione del frammento prima di coinvolgere la precipitazione dell'RNA.
Come potete vedere qui nella quarta corsia, otteniamo per entrambi i nostri frammenti campione di circa 150 nucleotidi ciascuno. Abbiamo quindi proceduto con meRIP-Seq. Il primo passo consiste nella coppia di perline magnetiche A / G con anticorpi anti-m6A o controlli IgG.
Per ogni piano di reazione, trasferire 25 microlitri di perline magnetiche in un tubo fresco. Si prega di notare che è necessaria almeno una condizione specifica per m6A e una condizione di controllo. Lavare ogni 25 microlitro di perline con 250 microlitri di buffer IP.
Risospesciare delicatamente le perline tubando su e giù e posizionare il tubo sul rack magnetico per un minuto per consentire la separazione delle perline. Rimuovere e scartare il surnatante, facendo attenzione a non aspirare le perle magnetiche e ripetere la fase di lavaggio una volta. Quindi risospendere le perle magnetiche in 100 microlitro di buffer IP per ogni 25 microlitro di volume originale di perline.
Preparare ed etichettare un tubo per ogni condizione. Nel nostro caso, avremo due tubi per la condizione infetta, uno per m6A e uno per il controllo IgG e due tubi per la condizione non infetta. Quindi aggiungere 100 microlitro di perline lavate in ciascun tubo.
Le perline sono ora pronte per essere accoppiate con anticorpi specifici o controlli IgG. Aggiungere cinque microgrammi di anticorpo specifico anti-m6A o anticorpo anti-IgG a ciascun tubo contenente 100 microlitro di perline magnetiche lavate. Consentire la coniugazione anticorpo-perline incubando il tubo per 30 minuti su una ruota rotante.
Nel frattempo, procedere con la preparazione del campione. Per ogni condizione pianificata, specifica per m6A o controllo IgG, il materiale di partenza sarà di 2,5 microgrammi di mRNA frammentato 100 microlitri di acqua. Per avere un volume di reazione finale di 500 microlitro, aggiungere 295 microlitri di acqua a ciascun campione.
Aggiungere quindi cinque microlitri di inibitore della RNAasi concentrati a 40 unità per microlitro per una quantità totale di 200 unità per campione e mescolare delicatamente. Infine aggiungere 100 microlitro di buffer IP concentrato 5X a ciascun tubo. I campioni sono ora pronti per la reazione di precipitazione immunitaria.
Recupera le perle magnetiche accoppiate con gli anticorpi dalla ruota rotante e spinale verso il basso. Aggiungere quindi 500 microlitro dei campioni precedentemente preparati a ciascun 100 microlitro di perline accoppiati con gli anticorpi specifici. Mescolare delicatamente pipettando su e giù più volte per risospese completamente le perline.
Incubarli o la tua reazione meRIP su una ruota rotante a quattro gradi durante due ore. Una volta terminata l'incubazione, ruotare verso il basso ogni tubo e posizionarli su un rack magnetico per un minuto per consentire la separazione delle perline. Quindi rimuovere la frazione non legata e posizionarla su un tubo fresco e conservarla per ulteriori analisi, se necessario.
Rimuovere il magnete dal rack e risospescere tutti i campioni in 500 microlitri di buffer IP. Risospendare accuratamente ogni campione pipettando su e giù. Inserire il magnete sul rack, incubare per un minuto, quindi rimuovere con cura il surnatante.
Ripetere il lavaggio due volte, quindi procedere con l'eluizione. Per ogni coppia di campioni, specifici m6A e di controllo, preparare 225 microlitri di tampone di eluizione contenente 20 millimolari di m6A purificato. Quindi aggiungere 100 microlitro di tampone di eluizione per campione.
Incubare tutti i campioni un'ora a quattro gradi su un bilanciere. Quindi raccogliere tutto il campione di RNA arricchito con m6A in un tubo fresco e procedere con un secondo ciclo di eluizione. Purifica l'RNA arricchito con m6A con il tuo metodo di scelta E poi a questo punto i campioni sono pronti per la preparazione e il sequenziamento della libreria.
Per indagare sulla modifica m5C, utilizziamo la conversione del bisolfito. Inizia l'esperimento con 500 nanogrammi di RNA poli-adenilato. Sebbene facoltativo, l'aggiunta al campione di 500 picogrammi di RNA impoverito di poli-A per garantire la rappresentazione ribosomiale e 0,5 microlitro di sequenza sintetica disponibile in commercio consentirà di valutare il tasso di conversione del bisolfito al momento del sequenziamento.
Regolare il campione su un volume finale di 20 microlitri in acqua, quindi aggiungere 130 microlitro di reagente di conversione dell'RNA a ciascun campione. Mescolare con cura pipettando su e giù e far girare tutto il campione per assicurarsi che non rimangano goccioline sul lato dei tubi. Incubare tutto il campione in una macchina PCR per tre cicli di denaturazione a 70 gradi per cinque minuti e conversione del bisolfito a 54 gradi per 45 minuti.
Eseguire la deaminazione in colonna aggiungendo direttamente su una colonna vuota, 250 microlitri di buffer di legame dell'RNA, 150 microlitro del campione convertito di bisolfito. Mescolare il campione tubando su e giù, ma prestando attenzione a non toccare i filtri a colonna. Aggiungere 400 microlitri di etanolo al 95-100% alla miscela tampone legante l'RNA del campione direttamente nella colonna.
Chiudere il tappo e mescolare immediatamente per inversione. Girare verso il basso il campione per 30 secondi ed eliminare il flusso. Lavare la colonna con tampone di lavaggio e quindi aggiungere 200 microlitri di soluzione di desolfonazione al centro di ogni colonna.
Incubare tutto il campione per 30 minuti a temperatura ambiente. Girare verso il basso il campione per 30 secondi e poi procedere con due cicli di lavaggio. Aggiungere 400 microlitri di tampone di lavaggio a ciascun campione, centrifugare per 30 secondi a piena velocità ed eliminare il flusso attraverso.
Posizionare la colonna in un nuovo tubo vuoto ed eluire l'RNA convertito in bisolfito in 20 microlitri di acqua. Controllare l'efficienza di conversione del bisolfito mediante RT-qPCR e quindi procedere alla preparazione e al sequenziamento della libreria. Dopo l'analisi bioinformatica, ecco alcuni esempi di risultati che è possibile ottenere con questo flusso di lavoro.
Qui confrontiamo l'epitrascrittoma delle cellule infette da HIV rispetto alle cellule non infette. a 24 ore dopo l'infezione. Nel pannello A, puoi vedere i risultati che otteniamo esplorando l'epitrastoma m6A.
In questo grafico, tracciamo le letture arricchite m6A sull'analisi meRIP-Seq. Possiamo vedere bene che un dito di zinco è ipermetilato 24 ore dopo l'infezione. Abbiamo eseguito lo stesso tipo di analisi per l'indagine sull'epitrastoma m5C nel pannello B.In questo grafico, ogni citosina non metilata viene visualizzata in rosso, mentre la proporzione di citosina che è stata metilata m5C è mostrata in blu.
Come puoi vedere, PHLPP1, tutte e tre le citosine che sono iper-metilate 24 ore dopo l'infezione da HIV. Nel complesso, questo flusso di lavoro consente di indagare sia l'epitrastoma M6A che m5C delle cellule infette e può essere applicato come tale anche su particelle virali. La comprensione dell'infezione virale è in grado di modificare il panorama epitrascrittomico dell'ospite ci darà accesso a un nuovo livello di regolazione.
Lo studio dei trascritti metilati differenziali sull'infezione virale fornirà naturalmente una risorsa preziosa per un nuovo intervento terapeutico. Al link qui sotto puoi trovare la nostra risorsa ad accesso aperto per l'indagine della trascrizione metilata differenziale sull'infezione da HIV nel tempo.
