こんにちは,このビデオでは、ウイルス感染時のm6Aおよびm5Cエピトランスクリプションを探索する方法を紹介します。実験を開始するには、感染していない細胞に5,000万個、感染した状態に5,000万個の細胞が必要です。分析時に高品質のデータセットを取得するには、ユニバーサル感染を達成する必要があります。
ここでは、これらの細胞をHIVベースのベクターで感染させ、FACSによってウイルスにコードされたGFPを測定する。この場合、感染細胞の80%を有し、RNAの総抽出から始まるワークフローを進めた。そこで、細胞をそれぞれ1000万個のアリコートに分け、トリゾールの1mLでライスしました。
その後、細胞リセートに200マイクロリットルのクロロホルムを添加し、反転によって混合した。この時点で、lysatsatを室温で3分間座らせ、すべてのサンプルを4度で15分間高速で遠心分離します。次に示すように、3 つの異なるフェーズでフェーズ分離が行われます。
RNAは上相に座っているので、有機層を移さないで注意を払って水相を新しいチューブに慎重に移します。この時点で、水相に0.5mLのイソプロパノールを加え、反転によって慎重に混ぜます。サンプルは、RNA沈殿を確実にするために80度で1時間インキュベートすることができます。
高速で遠心分離すると、ここに示すように素敵なRNAペレットを見ることができるはずです。慎重に上清を反転またはピペットによって廃棄し、ペレットを破壊しないことに注意を払う。その後、RNAペレットを75%分子グレードエタノールの1mLで洗浄します。
そして、サンプルを簡単に渦を出します。遠心分離の際、素敵な白色RNAペレットを必ず取り出してください。上清を捨て、RNAペレットを室温で15分間乾燥させます。
20マイクロリットルの水で各ペレットを再懸濁し、同じ条件からすべてのサンプルを一緒にプールします。総RNAは、ポリA選択によるmRNAの単離に対応する準備が整いました。RNAの75マイクログラムの各サンプルに対して、200マイクロリットルのオリゴDT磁気ビーズを調製し、結合緩衝液の1mLで洗浄します。
チューブを磁気スタンドに置き、ビーズを1回のミックス中に磁石に結合できるようにします。上清を捨て、2回目の洗浄のために手順を繰り返します。次に、磁気スタンドからビーズを取り出し、100マイクロリットルの結合バッファーで慎重に再懸濁します。
この時点で、100マイクロリットルの水に再懸濁されたアリコート当たり75マイクログラムのRNAに分割してRNAサンプルを調製する。100マイクロリットルの結合バッファーを加え、65度で2分間インキュベートします。その後、サンプルをスピンダウンし、氷の上でインキュベートします。
次に、洗浄した磁気ビーズを100マイクロリットルずつ各RNAサンプルに加え、室温で15分間回転ホイールに結合します。インキュベーション時に、チューブを磁気ラックに戻し、1分間インキュベートします。その後、新しいチューブに上清を回復し、分離の第二ラウンドのためにそれを脇に保ちます。
200マイクロリットルの洗浄バッファーでビーズを2回洗い、溶出に進みます。磁気ビーズから選択したポリARNAを溶出させるために、各サンプルとピペットに20マイクロリットルの氷冷TRIS HClを慎重に加えます。その後、サンプルを80度で2分間インキュベートし、ビーズからRNAを放出します。
ポリA選択RNAを含む上清を新鮮なチューブに移し、ビーズの持ち越しを避けるように注意してください。溶出ステップと分離ステップは、mRNA収率を上げるために2回繰り返す必要があります。mRNAは、断片化ステップでmeRIP-Seqパイプラインに入るか、バイサルファイト変換に直接進む準備が整いました。
meRIP-Seq パイプラインに入る最初のステップは mRNA 断片化で構成されます。このためには、0.2 mLチューブで18マイクロリットルのアリコートに分けられたmRNAの5マイクログラムが必要です。一貫性のあるデータを確保するには、その時点でサンプルを少なくして迅速に作業することが重要です。
この実験では、断片化が最適化され、115~200ヌクレオチドの間のサイズの断片が得られます。次に、18マイクロリットルのmRNAを含む各チューブに2マイクロリットルの断片化試薬を加え、チューブ壁に液滴を堆積させる際に注意を払う。試薬とRNAとの接触を同時に可能にするためにすべてのサンプルをスピンダウンし、70度で15分間インキュベートします。
インキュベーションが終わったら、0.5 M EDTAの2マイクロリットルを加えて反応を止める。この時点で、フラグメント化した mRNA を選択した方法で精製し、フラグメントアナライザーによる RNA 品質管理に進むことができます。このステップは任意ですが、RNA沈殿を引き込む前に断片のサイズを評価することができます。
4番目のレーンで見ることができるように、我々は、それぞれ約150ヌクレオチドの我々のサンプル断片の両方について得る。その後、私たちはmeRIP-Seqを進めました。最初のステップは抗m6A抗体またはIgG制御を用いた結合A/G磁気ビーズで構成される。
各反応計画について、25マイクロリットルの磁性ビーズを新鮮なチューブに移します。少なくとも1つのm6A特有の条件と1つの制御条件が必要です。250マイクロリットルのIPバッファーで各25マイクロリットルのビーズを洗浄します。
ビーズの分離を可能にするために、ビーズを上下にピペットしてビーズを静かに再中断し、チューブを磁気ラックに1分間置きます。上清を取り出して捨て、磁気ビーズを吸引しないことに注意を払い、洗浄工程を一度繰り返します。その後、元のビーズの体積の25マイクロリットルごとに100マイクロリットルのIPバッファで磁気ビーズを再懸濁します。
各条件ごとに1つのチューブを準備し、ラベルを付けます。我々の場合、感染状態用の2つのチューブ、m6A用とIgGコントロール用のチューブ、および非感染状態用の2つのチューブがあります。次に、各チューブに100マイクロリットルの洗浄ビーズを加えます。
ビーズは、特定の抗体またはIgG制御と結合する準備が整いました。洗浄された磁気ビーズの100マイクロリットルを含む各チューブに特異的抗m6A抗体または抗IgG制御抗体の5マイクログラムを加える。回転ホイールでチューブを30分間インキュベートすることで、抗体ビーズの共役を可能にします。
その間、サンプル調製を進める。m6A特異的またはIgG制御の各計画条件に対して、出発物質は100マイクロリットルの水を再懸濁した断片化したmRNAの2.5マイクログラムになります。500マイクロリットルの最終的な反応量を持っている場合は、各サンプルに水の295マイクロリットルを追加します。
次に、1マイクロリットル当たり40単位で濃縮したRNAase阻害剤を5マイクロリットル加え、サンプルあたり合計200単位で混合し、穏やかに混ぜます。最後に、各チューブに5倍の濃縮IPバッファの100マイクロリットルを加えます。サンプルは免疫沈殿反応の準備が整いました。
回転ホイールから抗体と結合した磁気ビーズを取り出し、それらを回転させます。次に、前に調製したサンプルの500マイクロリットルを、特定の抗体と結合したビーズの各100マイクロリットルに加えます。ビーズを完全に再中断するために何度か上下にピペットを入れ、穏やかに混ぜます。
2時間の間に4度で回転ホイールにそれらをまたはあなたのmeRIP反応をインキュベートします。インキュベーションが終わったら、各チューブをスピンダウンし、1分間磁気ラックに置いてビーズの分離を可能にします。次に、非結合分数を除去し、新鮮なチューブ上に置き、必要に応じてさらなる分析のためにそれを維持します。
マグネットをラックから取り出し、500マイクロリットルのIPバッファですべてのサンプルを再中断します。各サンプルを上下にピペットして慎重に再中断します。磁石をラックに挿入し、1分間インキュベートしてから上清を慎重に取り出します。
洗浄を2回繰り返し、溶出を進めます。サンプルの各カップルについて、m6A特異的および対照、精製m6Aの20ミリモルを含む溶出緩衝液225マイクロリットルを調製する。その後、サンプルあたり100マイクロリットルの溶出バッファーを加えます。
すべてのサンプルをロッカーに4度で1時間インキュベートします。次に、新鮮なチューブに濃縮されたRNAサンプルをすべて集め、溶出の第2ラウンドを進めます。選択した方法でm6A濃縮RNAを精製し、この時点でサンプルはライブラリの準備とシーケンシングの準備ができています。
m5Cの改変を調べるには、バイサルファイト変換を用います。ポリアデニル化RNAの500ナノグラムで実験を開始します。任意ですが、リボソーム表現を確実にするためにポリA枯渇RNAのサンプル500ピコグラムを添加し、商業的に入手可能な合成配列の0.5マイクロリットルは、シーケンス時に亜硫酸塩変換率を評価することができます。
サンプルを水中20マイクロリットルの最終体積に調整し、各サンプルに130マイクロリットルのRNA変換試薬を加えます。上下にピペットを入れ、すべてのサンプルを回転して慎重に混ぜて、チューブの側面に液滴が残らないようにします。PCRマシンで全てのサンプルを5分間70度、バイサルファイト変換を55分間54度で3サイクルインキュベートします。
空のカラム、250マイクロリットルのRNA結合バッファー、150マイクロリットルのバイサルファイト変換サンプルに直接添加して、カラム内脱アミノ化を行います。上下にピペットを入れてサンプルを混ぜますが、カラムフィルターに触れないように注意してください。サンプルRNA結合バッファー混合物に95~100%エタノールの400マイクロリットルを直接カラムに加えます。
キャップを閉じて、反転によってすぐに混ぜます。サンプルを 30 秒間スピンダウンし、フロースルーを破棄します。洗浄バッファーでカラムを洗い、各カラムの中央に200マイクロリットルの脱硫溶液を加えます。
すべてのサンプルを室温で30分間インキュベートします。サンプルを30秒間回転させ、2ラウンドの洗浄を進めます。各サンプルに400マイクロリットルの洗浄バッファーを加え、遠心分離機を全速速で30秒間加え、流量を廃棄します。
カラムを新しい空のチューブに入れ、亜硫酸塩変換RNAを20マイクロリットルの水に溶出させます。RT-qPCRによるバイサルファイト変換効率を制御し、ライブラリの調製とシーケンシングに進みます。バイオインフォマティクス解析の際、このワークフローで得られる結果の例を次に示します。
ここでは、HIV感染細胞と非感染細胞のエピトランストランスクリプトームを比較します。24時間の感染後に。Aパネルでは、m6Aエピトランストランスクリプトームを探索する結果を見ることができます。
このグラフでは、meRIP-Seq分析にm6A濃縮読み込み値をプロットします。感染後24時間でジンクフィンガーが過メチル化されているのがうまくわかります。このグラフのパネル B.In m5Cエピトランスクリプトーム調査に対して同じタイプの分析を行い、非メチル化シトシンは赤で表示され、m5Cメチル化されたシトシンの割合は青色で示されています。
ご覧のように、PHLPP1は、24時間のHIV感染後にハイパーメチル化された3つのシトシンすべてである。全体として、このワークフローは、感染した細胞のM6Aとm5Cエピトランスクリプトームの両方を調査することを可能にし、同様にウイルス粒子にそのように適用することができる。ウイルス感染の理解は、宿主エピトランストランスクリプトの風景を変更することができ、私たちは規制の新しい層へのアクセスを与えるだろう。
ウイルス感染時の微分メチル化転写物の調査は、もちろん新しい治療介入のための貴重なリソースを提供する。以下のリンクでは、HIV感染時の微分メチル化転写産物の経時調査のためのオープンアクセスリソースを見つけることができます。
