هذا البروتوكول يجعل من الممكن لعزل بنجاح والثقافة السرطان الأولي المرتبطة الخلايا الليفية من سرطان الثدي مورين, لفحص الجسيمات النانوية الجديدة المصممة لاستهداف البيئة الدقيقة الورم. يمثل CAF الأولي النموذج الأكثر موثوقية وفسيولوجية للدراسات المختبرية لستروما الورم. في هذا البروتوكول، نقوم بوصف كيفية تحقيق أفضل عائد.
للبدء، قم بإعداد مزيج الهضم لتفكك الورم، ونقع شظايا الورم من ثلاثة إلى خمسة ملليمترات في المحلول بعد إغلاق الأنبوب بإحكام. قلب الأنبوب رأسا على عقب، والتحقق من أن جميع قطع الورم في الجزء السفلي من الأنبوب نحو الغطاء. ثم إرفاق أنبوب إلى الفصام الميكانيكية في السكن المناسب، وتشغيل برنامج الانفصال مصممة خصيصا للأورام صعبة.
بعد الركض، افصل الأنبوب، وضعه رأسا على عقب لاحتضان العينة عند 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة مع اهتزاز لطيف. ثم إعادة ربط الأنبوب إلى المفك في السكن المناسب، وتشغيل برنامج الانفصال عن الأورام صعبة مرتين، وضمان عدم وجود قطع الأنسجة الكبيرة تبقى في نهاية الإجراء. تصفية العينة من خلال مصفاة خلية 40 ميكرون في أنبوب 50 ملليلتر.
ثم اغسل الفلتر بعشرة ملليلترات من جهاز RPMI 1640 المتوسط والطرد المركزي. بعد الطرد المركزي، إعادة إنفاق بيليه في المخزن المؤقت PBE، تتألف من برنامج تلفزيوني، 0.5٪BSA، واثنين من EDTA ملليمولار، والعد الخلايا مع تريبان الأزرق. إصلاح العازلة إزالة الخلية الميتة ملزمة عن طريق تخفيف 20X ملزمة العازلة الأسهم الحل مع الماء المقطر مزدوجة معقمة.
اغسل الخلايا بخمسة ملليلترات من العازلة الملزمة 1X والطرد المركزي. بعد الطرد المركزي، إعادة إنفاق بيليه الخلية مع 0.1 ملليلتر من الميكروبات إزالة الخلايا الميتة لمدة تصل إلى 10 إلى الخلايا السابعة، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. أثناء الحضانة ، قم بإعداد حامل مغناطيسي تحت غطاء محرك السيارة ، وشنق أعمدة الفصل المغناطيسي الحديدي إليها ، مع الإشارة إلى النصائح لأسفل.
وازن الأعمدة مع 0.5 ملليلتر من المخزن المؤقت الربط البارد، وانتظر حتى يتم تدفق الحل من خلال. بعد الحضانة، إضافة 400 ميكرولتر من العازلة ملزمة الباردة إلى حبة وتعليق الخلية. قم بتحميل وحدة التخزين بالكامل على العمود وجمع النفايات السائلة في أنبوب 15 ملليلتر.
اغسل العمود أربع مرات مع 0.5 ملليلتر من العازلة الباردة ملزمة، وجمع مجموع النفايات السائلة في نفس الأنبوب. لاستنفاد الخلايا الليفية غير السرطانية المرتبطة بها، قم بتصفية تعليق الخلية باستخدام مصفاة خلايا 70 ميكرون مبللة ب PBS، وطاردة الخلايا. إزالة supernatant وإعادة إنفاق بيليه في 80 ميكرولتر من العازلة PBE الباردة.
إضافة 20 ميكرولتر من غير المرتبطة الورم الورم استنفاد كوكتيل. تخلط جيدا، واحتضان العينة في 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة في الظلام. أثناء الحضانة بالخرز، قم بإعداد أعمدة الاستنفاد المغناطيسي الحديدي على حامل مغناطيسي.
توازن الأعمدة مع اثنين من ملليلتر من المخزن المؤقت PBE الباردة وانتظر حتى يتم تدفق الحل من خلال. بعد الحضانة، إضافة 400 ميكرولتر من العازلة إلى حبة وتعليق الخلية. قم بتحميل وحدة التخزين بالكامل على العمود وجمع النفايات السائلة في أنبوب 15 ملليلتر.
اغسل العمود مرتين مع اثنين من ملليلتر من PBE. جمع مجموع النفايات السائلة في نفس الأنبوب، والطرد المركزي للنفايات السائلة. للاختيار الإيجابي للخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان ، وإعادة إنفاق بيليه في 80 ميكرولتر من العازلة PBE الباردة.
ثم في 20 ميكرولتر من الميكروبات الخلايا الليفية المرتبطة بالورم، واحتضان العينات في 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة في الظلام. أثناء الحضانة، قم بإعداد أعمدة فصل المغناطيسي الحديدي على حامل مغناطيسي وتوازنها مع 0.5 ملليلتر من العازلة PBE الباردة. بعد الحضانة، إضافة 400 ميكرولتر من PBE إلى حبة وتعليق الخلية.
قم بتحميل وحدة التخزين بالكامل على العمود، ودع الخلايا غير المبوبة تتدفق إلى أنبوب 15 ملليلتر. اغسل العمود ثلاث مرات مع 0.5 ملليلتر من المخزن المؤقت PBE ، وجمع إجمالي النفايات السائلة في نفس الأنبوب. إزالة العمود من المغناطيس ووضعه في أنبوب 1.5 ملليلتر.
إضافة ملليلتر واحد من PBE على العمود، ودفع المكبس فورا في العمود لطرد الخلايا. بعد الطرد المركزي، وإعادة إنفاق بيليه الخلية في حجم مناسب من DMEM، والبذور الخلايا في لوحة زراعة الأنسجة. تحقق من كثافة الخلية تحت المجهر، ووضع لوحة في 37 درجة مئوية، وثاني أكسيد الكربون 5٪ للسماح للخلايا على الانضمام والنمو.
أدى حقن خلايا لوسيفيراز 4T1 في وسادة الدهون الثديية للفئران الإناث إلى نمو كتلة ورم يمكن اكتشافها بعد خمسة أيام من الزرع. للعثور على نافذة التضحية التي هي كافية لعزل CAF، تم البحث عن حل وسط الأمثل بين ارتفاع حجم الورم والتصوير الإضاءة الحيوية من ناحية، وتقرح الورم الناشئة ونخر من ناحية أخرى. تم تعيين اليوم 20 كنقطة زمنية لتحسين استرداد الخلية، بعد عملية العزل.
وهناك حاجة إلى ممرين آخرين لعزل سكان CAFs ، من لوحة الخلايا القابلة للحياة التي تم جمعها ، واستنفاد الخلايا الليفية غير المرتبطة بالورم ، وإثراء الخلايا الليفية المرتبطة بالورم. كشفت خلايا CAF مورفولوجيا كبيرة على شكل مغزل ، نموذجية من الخلايا الليفية ، وكانت مختلفة عن الخلايا السرطانية 4T1. يتبع التعبير FAP أكثر من خمسة مقاطع تؤكد أن ثقافة CAF الأولية حافظت على خصائصها الأصلية.
عندما لم يتم الحفاظ على مدة ودرجة حرارة الحضانات مع الميكروبات ، تم العثور على استنساخ مع مورفولوجيا مختلفة بين الثقافة المعزولة. نمت هذه الخلايا الملوثة بشكل أسرع وسادت على ثقافة CAF الأساسية. CAFs ملزمة مع الإنسان فيريتين Hfn-FAP وظيفية نانو المخدرات زيادة في واحد إلى واحد، وتركيزات جزء الأجسام المضادة واحد إلى خمسة بثلاثة أضعاف، مقارنة مع HFN عارية.
على العكس من ذلك، بالنسبة للخلايا الورم 4T1، أظهرت HFN عارية ملزمة أعلى من HFN وظيفية. لزيادة شوائب الغلة من CAF معزولة، والحفاظ على المخازن المؤقتة الباردة، واحترام وقت الحضانة مع الخرز، وسحب ما يصل إلى أربعة أورام لكل عمود قبل خطوة الإثراء النهائي. يمكن استخدام CAFs المعزولة لفحص العديد من أدوية النانو المرشحة من حيث الفعالية الملزمة والإقبالية والصيدلانية قبل الشروع في تجارب ما قبل السريرية في الجسم الحي.
سمحت لنا عزلة CAF باختبار ما إذا كان يمكن استخدام الجسيمات النانوية لاستهداف البيئة الدقيقة للورم. مما يمهد الطريق إلى علاجات مستهدفة جديدة تعمل بالتعاون مع العلاج الكيميائي.
