Dieses Protokoll ermöglicht es, primäre krebsassoziierte Fibroblasten aus Murin-Brustkrebs erfolgreich zu isolieren und zu kulturieren, um neuartige Nanopartikel zu screenen, die auf die Tumormikroumgebung abzielen. Primäre CAF stellen das zuverlässigste und physiologischste Modell für In-vitro-Studien von Tumorstroma dar. In diesem Protokoll beschreiben wir, wie man einen optimalen Ertrag erzielt.
Bereiten Sie zunächst eine Verdauungsmischung für die Tumordissoziation vor und tränken Sie die drei bis fünf Millimeter großen Tumorfragmente nach dem festen Schließen des Röhrchens in der Lösung. Drehen Sie die Röhre auf den Kopf und überprüfen Sie, ob sich alle Tumorstücke am Boden der Röhre in Richtung der Kappe befinden. Befestigen Sie dann die Röhre an einem mechanischen Dissoziter im richtigen Gehäuse und führen Sie ein Dissoziationsprogramm durch, das speziell für zähe Tumore entwickelt wurde.
Nach dem Lauf das Röhrchen abnehmen und auf den Kopf stellen, um die Probe bei 37 Grad Celsius für 40 Minuten mit sanftem Schütteln zu inkubieren. Befestigen Sie dann den Schlauch wieder am Dissoziter im richtigen Gehäuse und führen Sie das Dissoziationsprogramm für zähe Tumore zweimal durch, um sicherzustellen, dass am Ende des Verfahrens keine großen Gewebestücke zurückbleiben. Filtern Sie die Probe durch ein 40 Mikron Zellsieb in einem 50 Milliliter Röhrchen.
Anschließend den Filter mit 10 Millilitern RPMI 1640 Medium und Zentrifuge waschen. Nach der Zentrifugation wird das Pellet in PBE-Puffer, bestehend aus PBS, 0,5% BSA und zwei Millimolar-EDTA, wieder aufgewendet und die Zellen mit Trypan Blue gezählt. Reparieren Sie den Bindungspuffer zur Entfernung toter Zellen, indem Sie die 20-fache Bindungspufferlösung mit sterilem doppelt destilliertem Wasser verdünnen.
Waschen Sie die Zellen mit fünf Millilitern 1X Bindungspuffer und Zentrifuge. Nach der Zentrifugation das Zellpellet mit 0,1 Milliliter mikroperlen zur Entfernung abgestorbener Zellen für bis zu 10 bis zu den siebten Zellen wieder aufsetzen und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Bereiten Sie während der Inkubation einen magnetischen Ständer unter der Haube vor und hängen Sie ferromagnetische Trennsäulen daran, wobei die Spitzen nach unten zeigen.
Gleichen Sie die Säulen mit 0,5 Milliliter Kaltbindungspuffer aus und warten Sie, bis die Lösung durchgeflossen ist. Nach der Inkubation 400 Mikroliter Kaltbindungspuffer zur Perle und Zellsuspension geben. Laden Sie das gesamte Volumen auf die Säule und sammeln Sie das Abwasser in einem 15-Milliliter-Rohr.
Waschen Sie die Säule viermal mit 0,5 Millilitern Kaltbindungspuffer und sammeln Sie das gesamte Abwasser im selben Röhrchen. Für die Erschöpfung von nicht krebsbedingten Fibroblasten filtern Sie die Zellsuspension mit einem 70-Mikron-Zellsieb, das mit PBS befeuchtet ist, und zentrifugieren Sie die Zellen. Entfernen Sie den Überstand und reißen Sie das Pellet in 80 Mikroliter kaltem PBE-Puffer wieder auf.
Fügen Sie 20 Mikroliter nicht tumorassoziierten Fibroblasten-Depletion-Cocktail hinzu. Gut mischen und die Probe bei 4 Grad Celsius für 15 Minuten im Dunkeln inkubieren. Bereiten Sie während der Inkubation mit Perlen ferromagnetische Erschöpfungssäulen auf einem magnetischen Ständer vor.
Gleichen Sie die Säulen mit zwei Millilitern kaltem PBE-Puffer aus und warten Sie, bis die Lösung durchgeflossen ist. Nach der Inkubation 400 Mikroliter Puffer zur Perle und Zellsuspension hinzufügen. Laden Sie das gesamte Volumen auf die Säule und sammeln Sie das Abwasser in einem 15-Milliliter-Rohr.
Waschen Sie die Säule zweimal mit zwei Millilitern PBE. Sammeln Sie das gesamte Abwasser in dasselbe Rohr und zentrifugiert das Abwasser. Für die positive Selektion krebsbedingter Fibroblasten wird das Pellet in 80 Mikrolitern kalter PBE-Puffer resuspendiert.
Dann bei 20 Mikrolitern tumorassoziierten Fibroblasten Mikroperlen und die Proben bei 4 Grad Celsius für 15 Minuten im Dunkeln inkubieren. Bereiten Sie während der Inkubation ferromagnetische Trennsäulen auf einem magnetischen Ständer vor und gleichen Sie sie mit 0,5 Milliliter kaltem PBE-Puffer aus. Nach der Inkubation 400 Mikroliter PBE zur Perle und Zellsuspension geben.
Laden Sie das gesamte Volumen auf die Säule und lassen Sie die unbeschrifteten Zellen in ein 15-Milliliter-Rohr fließen. Waschen Sie die Säule dreimal mit 0,5 Millilitern PBE-Puffer und sammeln Sie das gesamte Abwasser im selben Röhrchen. Entfernen Sie die Säule vom Magneten und legen Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Rohr.
Fügen Sie einen Milliliter PBE auf die Säule hinzu und drücken Sie den Kolben sofort in die Säule, um die Zellen auszuspülen. Nach der Zentrifugation das Zellpellet in einem geeigneten DMEM-Volumen wieder aufsetzen und die Zellen in einer Gewebekulturplatte aussäen. Überprüfen Sie die Zelldichte unter einem Mikroskop und legen Sie die Platte auf 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid, damit die Zellen anhaften und wachsen können.
Die Injektion von 4T1-Luciferase-Zellen in das Brustfettpolster weiblicher Mäuse führte fünf Tage nach der Implantation zum Wachstum einer nachweisbaren Tumormasse. Um ein Opferfenster zu finden, das für die CAF-Isolierung ausreicht, wurde ein optimaler Kompromiss zwischen höherer Tumorgröße und Biolumineszenzbildgebung auf der einen Seite und einer auftretenden Tumorulzeration und Nekrose auf der anderen Seite gesucht. Tag 20 wurde als Zeitpunkt für die Optimierung der Zellerholung nach dem Isolationsprozess festgelegt.
Zwei weitere Passagen wurden benötigt, um die Population von CAFs aus dem Panel der gesammelten lebensfähigen Zellen, der Erschöpfung von nicht tumorassoziierten Fibroblasten und der Anreicherung von tumorassoziierten Fibroblasten zu isolieren. CAF-Zellen zeigten eine große spindelförmige Morphologie, die typisch für Fibroblasten ist und sich von 4T1-Tumorzellen unterscheidet. Der FAP-Ausdruck, der über fünf Passagen folgte, bestätigt, dass die primäre CAF-Kultur ihre ursprünglichen Eigenschaften beibehalten hat.
Wenn Dauer und Temperatur der Inkubationen mit Mikroperlen nicht eingehalten wurden, wurden Klone mit unterschiedlicher Morphologie in der isolierten Kultur gefunden. Diese Kontaminantenzellen wuchsen schneller und setzten sich gegen die primäre CAF-Kultur durch. CAFs, die mit humanem Ferritin Hfn-FAP-funktionalisiertem Nanomedikament binden, erhöhten sich bei eins zu eins und ein bis fünf Antikörperfragmentkonzentrationen um das Dreifache im Vergleich zu blankem HFN.
Im Gegenteil, für Tumor-4T1-Zellen zeigte nacktes HFN eine höhere Bindung als funktionalisiertes HFN. Um die Ausbeute der Verunreinigung von isoliertem CAF zu erhöhen, halten Sie die Puffer kalt, respektieren Sie die Inkubationszeit mit Perlen und ziehen Sie bis zu vier Tumore pro Säule vor dem letzten Anreicherungsschritt. Die isolierten CAFs können verwendet werden, um mehrere Kandidaten-Nano-Medikamente in Bezug auf Bindung, Aufnahme und pharmakologische Wirksamkeit zu screenen, bevor mit präklinischen In-vivo-Experimenten fortgefahren wird.
Mit der CAF-Isolierung konnten wir testen, ob Nanopartikel verwendet werden können, um die Mikroumgebung des Tumors anzusprechen. Damit wird der Weg zu neuen zielgerichteten Therapien geebnet, die in Synergie mit der Chemotherapie arbeiten.
