将原发性癌症相关纤维细胞与乳腺癌的合成素 Murine 模型分离，用于靶向纳米粒子的研究

该协议使成功分离和培养与纤维细胞相关的原发性癌症与穆林乳腺癌，筛选出新的纳米粒子，旨在瞄准肿瘤微环境。初级CAF是肿瘤频闪体体外研究最可靠、最生理的模型。在此协议中，我们描述了如何实现最佳收益。

首先，为肿瘤分离准备消化组合，在紧紧关闭管子后将三到五毫米的肿瘤片段浸泡在溶液中。将管子倒置，检查所有肿瘤的碎片是否在管子底部朝向盖子。然后将管子连接到适当的外壳中的机械分离器上，并运行专为硬肿瘤设计的分离程序。

运行后，分离管子，并将其倒置，在37摄氏度下孵育样品40分钟，轻轻摇晃。然后将管子重新连接到适当的外壳分离器上，并运行硬肿瘤的分离程序两次，确保手术结束时不会留下大组织块。在 50 毫升管中通过 40 微米细胞过滤器过滤样品。

然后用 RPMI 1640 中离心机的 10 毫升洗涤器。离心后，将颗粒重新沉入PBE缓冲器中，由PBS、0.5%BSA和两毫摩尔EDTA组成，并用Trypan Blue计算细胞。通过用无菌双蒸馏水稀释 20 倍绑定缓冲器库存溶液来修复死细胞去除结合缓冲器。

用5毫升1倍结合缓冲器和离心机清洗细胞。离心后，用0.1毫升的死细胞去除微珠将细胞颗粒重新用于10至7个细胞，并在室温下孵育15分钟。在孵化过程中，在引擎盖下准备一个磁立柱，并将铁磁分离柱悬挂到它，提示指向下。

用 0.5 毫升的冷结合缓冲器使柱子等价，并等待解决方案流过。孵化后，在珠子和细胞悬浮液中加入400微升冷结合缓冲器。将整个体积加载到柱子上，然后用 15 毫升的管子收集污水。

用 0.5 毫升的冷结合缓冲器清洗柱子四次，并在同一管中收集总污水。对于非癌症相关成纤维细胞的耗竭，使用用 PBS 滋润的 70 微米细胞过滤细胞悬浮物，并离心细胞。取出超高颗粒，在80微升冷PBE缓冲器中重新使用颗粒。

加入20微升非肿瘤相关成纤维细胞耗竭鸡尾酒。混合好，在4摄氏度下孵育样品，在黑暗中15分钟。在与珠子的孵化过程中，在磁架上准备铁磁耗竭柱。

用两毫升冷 PBE 缓冲器使柱子等价，并等待解决方案流过。孵化后，在珠子和细胞悬浮液中加入400微升缓冲液。将整个体积加载到柱子上，然后用 15 毫升的管子收集污水。

用两毫升的 PBE 清洗柱子两次。将总污水收集到同一管中，并离心出水。对于癌症相关成纤维细胞的阳性选择，将颗粒重新用于 80 微升冷 PBE 缓冲器中。

然后在20微升肿瘤相关的成纤维细胞微珠，并在4摄氏度的黑暗中孵育样品15分钟。在孵化过程中，在磁架上准备铁磁分离柱，并用0.5毫升的冷PBE缓冲器将其平衡。孵化后，在珠子和细胞悬浮中加入400微升PBE。

将整个体积加载到柱子上，让未标记的细胞流进 15 毫升管中。用 0.5 毫升 PBE 缓冲器清洗柱子三次，并在同一管中收集总污水。从磁铁中取出柱子，放入 1.5 毫升管中。

在柱子上加入一毫升的PBE，并立即将柱塞推入柱子以冲洗细胞。离心后，将细胞颗粒重新消耗在适当的DMEM体积中，并将细胞播种在组织培养板中。在显微镜下检查细胞密度，将板置于37摄氏度和5%的二氧化碳，让细胞粘附和生长。

将4T1荧光细胞注射到雌性小鼠的乳腺脂肪垫中，导致植入5天后可检测到的肿瘤质量的生长。为了找到一个足以进行CAF隔离的牺牲窗口，我们一方面在肿瘤体型和生物发光成像之间寻求最佳的妥协，另一方面在肿瘤溃疡和坏死之间寻求最佳的妥协。第20天被设定为在隔离过程之后优化细胞恢复的时间点。

还需要两段话来分离CAF的种群，从收集的活细胞面板中分离，非肿瘤相关成纤维细胞的耗竭，以及肿瘤相关成纤维细胞的富集。CAF细胞揭示了大主轴形状的形态，典型的成纤维细胞，与4T1肿瘤细胞不同。FAP的表达经过五段，证实主要的CAF文化保持了其原始特征。

当微珠孵化的持续时间和温度得不到维持时，在孤立的培养物中发现了具有不同形态的克隆。这些污染物细胞生长得更快，并战胜了主要的CAF培养。与裸HFN相比，与人类费里汀Hfn-FAP功能纳米药物结合的CAF以1比1和1比5的抗体片段浓度增加了三倍。

相反，对于肿瘤4T1细胞，裸HFN表现出比功能化HFN更高的结合。为了增加分离的CAF的产量杂质，保持缓冲器冷，尊重珠子的孵化时间，并在最后的浓缩步骤之前每列拉多达4个肿瘤。分离的CAF可用于筛选几个候选纳米药物的结合，吸收和药理疗效，然后再进行临床前体内实验。

CAF隔离使我们能够测试纳米粒子是否可用于瞄准肿瘤微环境。从而为与化疗协同作用的新靶向疗法铺平了道路。