Este protocolo permite isolar e cultivar com sucesso fibroblastos associados ao câncer primário a partir do câncer de mama murin, para tela de novas nanopartículas projetadas para atingir o ambiente de micro tumores. O CAF primário representa o modelo mais confiável e fisiológico para estudos in vitro de estroma tumoral. Neste protocolo, descrevemos como alcançar um rendimento ideal.
Para começar, prepare uma mistura de digestão para dissociação do tumor, e mergulhe os fragmentos tumorais de três a cinco milímetros na solução depois de fechar firmemente o tubo. Vire o tubo de cabeça para baixo, verificando se todos os pedaços do tumor estão na parte inferior do tubo em direção à tampa. Em seguida, conecte o tubo a um dissociador mecânico na carcaça adequada, e execute um programa de dissociação especificamente projetado para tumores resistentes.
Após a corrida, desprende o tubo e coloque-o de cabeça para baixo para incubar a amostra a 37 graus Celsius por 40 minutos com agitação suave. Em seguida, recoloque o tubo ao dissociador na carcaça adequada, e execute o programa de dissociação para tumores resistentes duas vezes, garantindo que não haja grandes pedaços de tecido no final do procedimento. Filtre a amostra através de um coador de células de 40 mícrons em um tubo de 50 mililitros.
Em seguida, lave o filtro com 10 mililitros de RPMI 1640 médio e centrífuga. Após a centrifugação, resuspenque a pelota no buffer PBE, composto por PBS, 0,5% BSA e dois milimôlares EDTA, e conte as células com Trypan Blue. Repare o tampão de ligação de célula morta diluindo a solução de estoque tampão de ligação de 20X com água destilada dupla estéril.
Lave as células com cinco mililitros de tampão de ligação 1X e centrífuga. Após a centrifugação, resuspenja a pelota celular com 0,1 mililitro de microesferas de remoção de células mortas por até 10 a 7 células, e incubar à temperatura ambiente por 15 minutos. Durante a incubação, prepare um suporte magnético sob o capô, e pendure colunas de separação ferromagnéticas para ele, com as pontas apontando para baixo.
Equilibre as colunas com 0,5 mililitros de tampão de ligação a frio e espere até que a solução flua. Após a incubação, adicione 400 microliters de tampão de ligação fria à suspensão da conta e da célula. Coloque todo o volume na coluna e colete o efluente em um tubo de 15 mililitros.
Lave a coluna quatro vezes com 0,5 mililitros de tampão de ligação fria e colete o efluente total no mesmo tubo. Para o esgotamento de fibroblastos associados ao não-câncer, filtre a suspensão celular usando um coador de células de 70 mícrons umedecido com PBS, e centrifugar as células. Remova o supernatante e resuspenja a pelota em 80 microliters de tampão PBE frio.
Adicione 20 microliters de coquetel de esgotamento do fibroblasto não associado ao tumor. Misture bem, e incubar a amostra a 4 graus Celsius por 15 minutos no escuro. Durante a incubação com contas, prepare colunas de esgotamento ferromagnético em um suporte magnético.
Equilibre as colunas com dois mililitros de tampão PBE frio e espere até que a solução flua. Após a incubação, adicione 400 microliters de tampão à suspensão de contas e células. Coloque todo o volume na coluna e colete o efluente em um tubo de 15 mililitros.
Lave a coluna duas vezes com dois mililitros de PBE. Colete o efluente total no mesmo tubo e centrifufique o efluente. Para a seleção positiva de fibroblastos associados ao câncer, resuspenque a pelota em 80 microliters de tampão PBE frio.
Em seguida, em 20 microlitres de micróbios associados ao tumor, e incubar as amostras a 4 graus Celsius por 15 minutos no escuro. Durante a incubação, prepare colunas de separação ferromagnética em um suporte magnético e equilibre-as com 0,5 mililitros de tampão PBE frio. Após a incubação, adicione 400 microliters de PBE à suspensão de contas e células.
Carregue todo o volume na coluna e deixe as células sem rótulos fluírem através de um tubo de 15 mililitros. Lave a coluna três vezes com 0,5 mililitros de tampão PBE e colete o efluente total no mesmo tubo. Remova a coluna do ímã e coloque-a em um tubo de 1,5 mililitro.
Adicione um mililitro de PBE na coluna e empurre imediatamente o êmbolo para dentro da coluna para lavar as células. Após a centrifugação, resuspenque a pelota celular em um volume apropriado de DMEM, e semee as células em uma placa de cultura tecidual. Verifique a densidade celular sob um microscópio, e coloque a placa a 37 graus Celsius, e 5% dióxido de carbono para permitir que as células aderam e cresçam.
A injeção de células luciferase 4T1 na almofada de gordura mamária de camundongos fêmeas levou ao crescimento de uma massa tumoral detectável cinco dias após a implantação. Para encontrar uma janela de sacrifício adequada para o isolamento do CAF, foi buscado um comprometimento ideal entre maior tamanho do tumor e bioluminescência por um lado, e uma ulceração tumoral emergente e necrose, por outro lado. O dia 20 foi definido como o ponto de tempo para otimizar a recuperação celular, após o processo de isolamento.
Foram necessárias mais duas passagens para isolar a população de CAFs, do painel de células viáveis coletadas, o esgotamento de fibroblastos não associados ao tumor e o enriquecimento de fibroblastos associados ao tumor. As células CAF revelaram uma grande morfologia em forma de fuso, típica dos fibroblastos, e eram diferentes das células tumorais 4T1. A expressão fap seguiu mais de cinco passagens confirmando que a cultura primária do CAF manteve suas características originais.
Quando a duração e a temperatura das incubações com microesferas não foram mantidas, foram encontrados clones com diferentes morfologias entre a cultura isolada. Essas células contaminantes cresceram mais rápido e prevaleceram sobre a cultura principal do CAF. CaFs ligados com a droga nano funcionalizada Human Ferritin Hfn-FAP aumentaram em uma para uma, e concentrações de fragmentos de anticorpos de um a cinco por três vezes, em comparação com hfn nua.
Pelo contrário, para as células tumorais 4T1, hfn nua mostrou maior ligação do que HFN funcionalizada. Para aumentar a impureza de rendimento do CAF isolado, mantenha os tampões frios, respeite o tempo de incubação com contas e puxe até quatro tumores por coluna antes da etapa final de enriquecimento. Os CAFs isolados podem ser usados para triagem de várias nanodrogas candidatas em termos de vinculação, absorção e eficácia farmacológica antes de prosseguir com experimentos in vivo pré-clínicos.
O isolamento da CAF nos permitiu testar se nanopartículas podem ser usadas para atingir o microambiente tumoral. Assim, abrindo caminho para novas terapias-alvo que trabalham em sinergia com quimioterapia.
