يركز بحثنا على علاج نقائل سرطان الثدي باستخدام العلاجات الموجهة بالصور على منصة جسيمات أكسيد الحديد النانوية. الهدف هو تطوير علاجات فعالة موجهة بشكل خاص إلى الأنسجة النقيلية ، والتي تعد الأسباب الرئيسية للوفاة المرتبطة بالسرطان. قد يكون من الصعب تحديد ما إذا كانت العلاجات الجهازية قد وصلت إلى الأنسجة المرغوبة دون التضحية بالحيوانات.
يمكن تصوير الجسيمات النانوية الخاصة بنا باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي وطرق التصوير البصري ، مما يسمح لنا بمراقبة توصيل الدواء وتراكمه في الحية. العلاجات الحالية لسرطان الثدي النقيلي ليست خاصة بالنقائل ، ولها فعالية متغيرة ، وتسبب آثارا جانبية غير مرغوب فيها. تستهدف منصة الجسيمات النانوية الخاصة بنا على وجه التحديد المكانة النقيلية وتسمح بالمراقبة غير الغازية لتوصيلها دون أي دليل على الآثار الضارة.
في السابق ، استخدمنا منصة الجسيمات النانوية الخاصة بنا لاستهداف محرك ورم خبيث ، miR-10b ، وتمكنا من إيقاف ورم خبيث ونمو النقائل. مع التركيز على الترجمة السريرية ، نبحث في الديناميكا الدوائية لهذه التركيبة لتحسين نظام العلاج وزيادة الفعالية. للبدء ، ضع Matrigel المجمد على حرارة 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة للسماح لمستخلص المصفوفة بالتسييل.
بعد تحديد العدد الإجمالي للخلايا اللازمة للدراسة ، قم بتربسين الخلايا وغسلها باستخدام PBS. الطرد المركزي للخلايا عند 200 جم لمدة 5 دقائق. ثم أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من PBS المبرد لإنشاء مخزون الخلية.
الآن ، قم بتخفيف العدد الكلي للخلايا إلى 40 في 10 أس 6 خلايا لكل مليلتر. ثم أضف حجما متساويا من مستخلص المصفوفة المبردة لتحقيق تركيز نهائي 1 في 10 إلى قوة 6 خلايا لكل 50 ميكرولتر. احتفظ بالخليط على الثلج لمنع المستخلص من التصلب قبل الزرع.
انقل الفأر المخدر إلى مخروط الأنف على وسادة التدفئة. بعد التأكد من المستوى الجراحي للتخدير ، ضع مرهم العين لحماية العينين من جفاف القرنية. ثم نظف الجلد بالقرب من موقع الحقن بمنديل كحولي واتركه يجف لبضع ثوان.
الحث في الغدة الثديية رقم أربعة لتقليل تداخل الإشارة بين الورم الأولي ومواقع ورم خبيث شائعة. الآن ، قم بسحب مخزون الخلية لأعلى ولأسفل لإعادة تعليق الخلايا. اسحب 50 ميكرولترا من معلق الخلية الباردة المثلجة في حقنة الأنسولين بإبرة قياس 29.
أدخل شطبة الإبرة مباشرة أسفل حلمة الغدة الثديية المرغوبة ، بالتوازي مع جسم الفأر ، وحقن الخلايا بمعدل ثابت وبطيء. اترك الإبرة في الجلد لمدة 5 ثوان على الأقل بعد الانتهاء من الحقن للسماح ل Matrigel بالتصلب ومنع التسرب. بعد ذلك ، انقل الماوس إلى قفص نظيف على وسادة تسخين للتعافي والإشراف حتى يصبح متنقلا بالكامل ويمكنه الحفاظ على الاستلقاء القصي.
لمراقبة نمو الورم وتطور ورم خبيث ، قم بحقن 150 ملليغرام لكل كيلوغرام من وزن الجسم من لوسيفيرين داخل الصفاق في نموذج فأر سرطان الثدي النقيلي المخدر. أعد الفئران إلى قفصها على وسادة تسخين للسماح لها بإيقاظ واستقلاب اللوسيفيرين. بعد ذلك ، قم بتصوير الفئران باستخدام الماسح الضوئي لنظام التصوير ، بدءا من حوالي 10 دقائق بعد الحقن باللوسيفيرين.
صور ما يصل إلى 5 فئران معا في وضع ضعيف ، مما يضمن تضمين أجسامهم بالكامل في علامات دليل مجال الرؤية وتوجيهها بشكل مستقيم قدر الإمكان. استخدم شريطا شفافا لتأمين أذرعهم لتصور الغدد الليمفاوية الإبطية بشكل أفضل. الآن ، في برنامج نظام التصوير ، اضبط التعرض على تلقائي ، والتجميع على متوسط ، و FStop إلى 1 ، والإثارة للكتلة ، والانبعاث للفتح ، و FOV إلى D ، والارتفاع إلى 1.50 للتصوير الحيوي.
عند تصوير الورم الأساسي، الذي ينتج عادة إشارة قوية بسبب موقعه السطحي، اضبط التعرض على تلقائي. في حالة مراقبة النقائل ، قم بتغطية الورم الأساسي بعناية بشريط كهربائي أسود واضبط التعرض يدويا على 300 ثانية لالتقاط أي إشارات باهتة. للبدء ، قم بوزن فئران سرطان الثدي النقيلي ، حيث تعتمد جرعة Nanodrug على وزن الجسم.
تحضير حقنة الأنسولين بإبرة قياس 29 مملوءة ب 10 ملليغرام من الحديد Nanodrug لكل كيلوغرام من وزن جسم الفأر. ثم اغمر ذيل المخدر في ماء دافئ عند 30 إلى 35 درجة مئوية لمدة 30 ثانية لتوسيع أوردة الذيل. بعد ذلك ، امسح الماء الزائد من الذيل ونظف موقع الحقن بمنديل كحول بنسبة 70٪.
الآن ، أدخل شطبة الإبرة في وريد الذيل الجانبي في منتصف الذيل تقريبا. اسحب المكبس للخلف قليلا لتأكيد وضعه مع الفلاش باك للدم في الإبرة. عند الإدخال الناجح ، قم بحقن الدواء النانوي بثبات بمعدل بطيء من 5 إلى 10 ثوان تقريبا لحقن 40 ميكرولتر.
تأكد من الحقن الناجح بسبب عدم تجمع المحلول تحت جلد الذيل بالقرب من موقع الحقن ، وعن طريق سواد الوريد من محلول الجسيمات النانوية الداكنة. اضغط على موقع الحقن بالشاش وقم بإزالة الإبرة. حافظ على الضغط لمدة 30 ثانية تقريبا حتى يتوقف النزيف.
لجمع عينات ورم خبيث ، ابدأ بتصوير الفئران باستخدام التصوير الحيوي. بعد جمع النقائل ، ضع الأنسجة المجمعة في طبق بتري. في برنامج نظام التصوير ، اضبط التعرض على تلقائي ، والتجميع على متوسط ، و FStop إلى 1 ، والإثارة للكتلة ، والانبعاث للفتح ، و FOV إلى D ، والارتفاع على 1.50 للتصوير الحيوي.
للتصوير الفلوري ، اضبط التعرض على تلقائي ، والتجميع على متوسط ، و FStop إلى 1 ، والإثارة على 675 ، والانبعاث إلى 720 ، ومستوى المصباح إلى مرتفع ، ومجال الرؤية إلى D ، والارتفاع إلى 1.50. ثم قم بتصوير جثة الفأر باستخدام BLI لتحديد ما إذا كان هناك أي أنسجة سرطانية متبقية تستحق جمعها. بعد ذلك ، اشطف الأنسجة السرطانية المجمعة في PBS.
لجمع الأنسجة للفحص المجهري أو تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي ، قم بتضمينها في مركب درجة حرارة القطع الأمثل وتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى تصبح جاهزة للمعالجة. لجمع الأنسجة من أجل التحليل الطيفي للانبعاث البصري للبلازما المقترن بالحث ، قم بتجميع مقياس باستخدام أنبوب فارغ سعة 1.7 ملليلتر. ضع الأنسجة في الأنبوب وسجل وزنها.
بعد تجميد الأنسجة ، قم بتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى تصبح جاهزة للمعالجة. القطع بالتبريد درجة حرارة القطع المثلى تضمنت عينات مجمدة طازجة على شرائح الفحص المجهري بسمك 10 ميكرومتر. اضبط درجات حرارة الغرفة وحامل العينة بين 20 درجة مئوية تحت الصفر و 15 درجة مئوية تحت الصفر، اعتمادا على نوع الأنسجة.
ثبت أقسام الأنسجة على الشرائح عن طريق غمرها في محلول بارافورمالدهيد بنسبة 4٪ لمدة 15 دقيقة. شطف الشرائح بعناية مع PBS. ثم ينزلق غطاء التثبيت على الشرائح باستخدام وسيط يحتوي على DAPI لتصور بنية الأنسجة.
استخدم المجهر الفلوري لفحص أقسام الأنسجة بحثا عن تألق Cy5.5 ، مما يشير إلى توصيل الأدوية النانوية. تأكد من أن إشارة التألق ليست ضوضاء خلفية من خلال مقارنتها بعينة تحكم سلبية من غير محقون. أظهرت الفئران المعالجة بالنانو دواء إشارات حيوية كبيرة في نقائل الرئة بعد أسبوع واحد من تناولها ، مما يؤكد وجود نقائل في أنسجة الرئة.
أكد التصوير الفلوري تراكم Cy5.5 من Nanodrug فقط في أنسجة الرئة النقيلية للفئران المعالجة.
