كان الهدف العام من التجربة هو تحديد شظايا الحمض النووي المرتبطة بالبروتين في جميع أنحاء الجينوم ، والتي تعكس حالة الكروماتين. ولتحقيق هذا الهدف، نفذت ثلاث عمليات خاصة. بادئ ذي بدء ، تم عزل النوى السليمة من الخلايا النباتية.
ثانيا ، تم التعرف على التعديلات على الكروماتين بواسطة جسم مضاد محدد في الموقع. ثالثا ، الجسم المضاد الذي يربط بروتين اندماج A-transposase ، Tn5 transposase ، يشق الكروماتين في الموقع تحت تنشيط أيونات المغنيسيوم. ثم تم دمج شظايا الحمض النووي ومواقع ربط تعديل الكروماتين مع المحولات وأصبحت جاهزة لإعداد الحمض النووي.
عزز إثراء تفاعل البوليميراز المتسلسل تسلسل التوليد. يؤدي تنظيم علم الجينوم اللاجيني على المستوى اللوني ، بما في ذلك تعديلات الحمض النووي والهيستون ، وسلوكيات عوامل النسخ ، والحمض النووي الريبي غير المشفر مع بروتيناته المجندة ، إلى التحكم الزماني والمكاني في التعبير الجيني. تقنية CUT & Tag التي طورها Henikoff Lab هي طريقة ربط إنزيم لتنميط الكروماتين epigenomics بكفاءة عالية.
هنا نستخدم أوراق القطن كمواد تجريبية ، ولإجراء تنميط الكروماتين باستخدام الأجسام المضادة ل Histone H3 Lysine-4 Trimethylation كمثال. نحن نقدم بروتوكولا محسنا مع فيديو لأداء CUT & Tag في النباتات. لكل إعداد عينة باستخدام CUT & Tag ، تم جمع غرام من أنسجة أوراق القطن.
تم طحن الورقة إلى مسحوق ناعم مع النيتروجين السائل ، ونقلها إلى أنبوب صقر سعة 50 مل يحتوي على 25 مل من عازل العزل النووي المبرد A.تم خلط المحلول العازل بلطف ، وتم تحضين الأنبوب على الثلج لمدة خمس دقائق مع اهتزاز لطيف لتفريق المادة بالتساوي. ثم تم نسجها عند 500 قوة طرد مركزي نسبية أو RCF ، عند 4 درجات مئوية ، لمدة خمس دقائق ، لتشكيل حبيبات الخلية. تم صب السوبرناتانت وإعادة تعليق الكريات مع 20 مل من العازل النووي المبرد B ، مع استكمال 0.5 ٪ تريتون.
تم عكس الأنبوب بلطف لإعادة تعليق الكريات تماما. ثم تمت تصفية محللات الخلايا الناتجة بمزيج من اثنين من المناخل ، وتم استخدام غربال 500 شبكة في الأعلى لإزالة حطام الأنسجة الأكبر. وتم استخدام غربال 1000 شبكي في القاع لجمع النوى.
يعتمد اختيار حجم الشبكة المناسب للغربال على حجم نوى النباتات. تم استخدام ورق ترشيح معقم على الجانب الخلفي من الغربال لامتصاص جزء من الليزات وحطام الخلايا الصغيرة. تم نقل الليزات التي تحتوي على النوى إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 ملليلتر ، ونسج عند 300 تريليون قدم مكعب لمدة أربع دقائق ، عند 4 درجات مئوية مئوية لجمع النوى.
بعد الطرد المركزي ، تم استخدام طرف ماصة لإزالة أكبر قدر ممكن من المادة الفائقة. كمية 800 ميكرولتر ، تمت إضافة مخزن مؤقت للغسيل النووي. وتم عكس الأنبوب بلطف لإعادة تعليق النوى.
تم نسج الأنبوب مرة أخرى عند 300 تريليون قدم مكعب ، لمدة أربع دقائق عند 4 درجات مئوية. بعد ما مجموعه ثلاث غسلات ، تم دمج النوى الناتجة في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 ملليلتر ، ونسجت عند 300 تريليون قدم مكعب ، لمدة أربع دقائق عند 4 درجات مئوية. تم استخدام طرف ماصة لإزالة أكبر قدر ممكن من المخزن المؤقت المتبقي.
كانت الخطوة التالية هي حضانة الجسم المضاد. تم إعادة تعليق أليكوت من 50 ميكرولتر من النوى في 1 ملليلتر من المخزن المؤقت للأجسام المضادة المكمل ب EDTA و BSA وكوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني في الديجيتونين. تم وضع أليكوت من 150 ميكرولتر من تعليق النوى في أنبوب جديد 1.5 ملليلتر لتفاعل واحد ، تمت إضافة ميكرولترين من الأجسام المضادة إلى كل أنبوب.
في هذا الفحص ، تم إعداد نسختين بيولوجيتين للأجسام المضادة المضادة للهيستون H3-Lysine-4-Trimethylation ومجموعات التحكم السلبية في الغلوبولين المناعي G بعد إضافة الأجسام المضادة. تم خلط المحلول بلطف ، وتركت الأنابيب على شاكر أفقي للتهجين بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية في 12 دورة في الدقيقة. في صباح اليوم التالي ، تم إخراج الأنابيب وتم غسل النوى باستخدام 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت لغسل الأمطار المناعية.
تم عكس الأنبوب بلطف للخلط وتم تركه على الخلاط الأفقي لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة في 12 دورة في الدقيقة. بعد الغسيل ، تم نسج الأنبوب عند 300 تريليون قدم مكعب لمدة أربع دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، تمت إزالة supernatant باستخدام طرف ماصة.
وقد تكرر هذا لما مجموعه ثلاث غسلات. بعد الغسيل الثالث ، تم نسج الأنبوب 300 rcf لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية ، وتم استخدام طرف ماصة لإزالة المخزن المؤقت المتبقي قدر الإمكان. لإعداد مزيج ترانسبوساز Tn5 للحضانة.
تمت إضافة ميكرولتر واحد من الترانسبوساز إلى كل 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت لحضانة transposase. نوصي بتحضير مزيج محلول الترانسبوساز أولا وفقا لعدد التفاعلات. ثم إضافة أليكوت من 150 ميكرولتر إلى كل أنبوب.
تم خلط المحلول بلطف وتركه على شاكر أفقي في درجة حرارة الغرفة في 12 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين. تم خلط الأنابيب بلطف كل 10 إلى 15 دقيقة. بعد الحضانة ، تم غسل النوى ثلاث مرات باستخدام 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت لغسل هطول الأمطار المناعي في درجة حرارة الغرفة لإزالة ترانسبوساز Tn5 غير المقيد.
بعد الغسيل الثالث ، تم نسج الأنبوب عند 300 rcf لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية ، وتم استخدام طرف ماصة لإزالة المخزن المؤقت المتبقي. بالنسبة لخطوة وضع العلامات ، تمت إضافة 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للوسم إلى أنبوب التفاعل. تم خلط المحلول جيدا وتحضينه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
بعد الحضانة ، تمت إضافة 10 ميكرولترات من 0.5 مول لكل لتر EDTA عند 30 ميكرولتر من 10٪ SDS لتحديد التفاعل. تمت إضافة 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت لاستخراج الحمض النووي. تم إجراء استخراج الحمض النووي غير المنتظم.
تم إذابة شظايا الحمض النووي في 25 ميكرولتر من الماء المعقم. تم استخدام 24 ميكرولتر لتضخيم PCR في بناء مكتبة NGS. يوضح هذا الشكل بقعة النوى السليمة مع DAPI في الصورة ، تحت المجهر الحصول على كمية كافية من النوى سليمة ونظيفة نسبيا هي الخطوة الحاسمة ل CUT & Tag.
بعد PCR ، تم نقل ميكرولترين وتم فحص حجم الحمض النووي على هلام الأغاروز بنسبة 1.5٪. يوضح هذا الشكل أنه مقارنة مع التحكم السلبي في جين الغلوبولين المناعي. يجب أن يتراوح الجزء الأكبر من شظايا الحمض النووي من عينة Histone H3 Lysine 4 Trimethylation من 280 إلى 500 زوج قاعدة.
يمكن تنقية شظايا الحمض النووي ثم توصيفها عن طريق تسلسل الإنتاجية العالية. يوضح هذا الشكل تسلسل توليد النتائج للجسم المضاد المضاد للهيستون H3 Lysine 4 Trimethylation مقارنة مع مجموعات التحكم السلبية في الغلوبولين المناعي G. تقوم هذه التقنية بإنشاء مكتبات الحمض النووي بدقة عالية وخلفية منخفضة بشكل استثنائي باستخدام عدد صغير من الخلايا مع إجراء مبسط مقارنة ب ChIP-seq.
CUT & Tag هي طريقة جديدة ولا تزال قيد التقدم.
