실험의 전반적인 목표는 크로마틴의 상태를 반영한 게놈 전체에서 단백질 관련 DNA 단편을 확인하는 것이 었습니다. 이 목표를 달성하기 위해 세 가지 특수 작업이 수행되었습니다. 우선, 식물 세포로부터 온전한 핵을 분리하였다.
둘째로, 크로마틴에 대한 변형은 계내에서 특이적 항체에 의해 인식되었다. 셋째, 단백질 A-트랜스포사제 융합 단백질인 Tn5 트랜스포사제를 테더링하는 항체는, 마그네슘 이온의 활성화 하에 크로마틴을 계내에서 절단한다. 이어서, DNA 단편 및 크로마틴 변형 결합 부위를 어댑터와 통합하고 DNA 준비를 준비하였다.
중합효소 연쇄 반응 농축 강화 생성 시퀀싱. DNA 및 히스톤 변형, 전사 인자의 거동 및 모집된 단백질과의 비코딩 RNA를 포함하는 색채 수준에 대한 에피게놈학 조절은 유전자 발현의 시간적 및 공간적 조절을 유도한다. Henikoff Lab에서 개발한 CUT&Tag 기술은 고효율로 크로마틴 에피게놈 프로파일링을 위한 효소 테더링 방법입니다.
여기서 우리는 실험 재료로서 목화 잎을 채용하고, 일례로 히스톤 H3 리신-4 트리메틸화의 항체를 사용하여 크로마틴 프로파일링을 수행한다. 우리는 공장에서 CUT&Tag 성능을 위한 비디오와 함께 세련된 프로토콜을 제공합니다. CUT&Tag를 사용한 각 샘플 준비에 대해, 면잎 조직의 그램을 수집하였다.
잎을 액체 질소로 미세분말로 분쇄하고, 냉각된 핵 분리 버퍼 A.The 완충액을 25 mL가 들어있는 50 mL 팔콘 튜브로 옮기고, 튜브를 부드럽게 진탕하여 5분 동안 얼음 위에서 인큐베이션하여 물질을 고르게 분산시켰다. 이어서, 500 상대 원심력 또는 rcf에서, 섭씨 4도에서, 5분 동안 회전시켜, 세포 펠릿을 형성하였다. 상청액을 디캔팅하고, 펠렛을 0.5%트리톤으로 보충된 냉각된 핵 분리 완충액 B의 20 mL로 재현탁시켰다.
튜브를 부드럽게 반전시켜 펠릿을 완전히 재현탁시켰다. 이어서, 생성된 세포 용해물을 두 개의 체들의 조합으로 여과하였고, 500-메쉬 체를 상부에 사용하여 더 큰 조직 파편을 제거하였다. 그리고 핵을 수집하기 위해 바닥에 1000 메쉬 체를 사용하였다.
체의 적절한 메쉬 크기의 선택은 식물의 핵의 크기에 달려 있습니다. 멸균 여과지는 용해물의 일부와 작은 세포 파편을 흡수하기 위해 체의 뒷면에 사용되었다. 핵을 함유하는 용해물을 신선한 1.5 밀리리터 원심분리 튜브로 옮기고, 섭씨 4도에서 4분 동안 300 rcf에서 회전시켜 핵을 수집하였다.
원심분리 후, 피펫 팁을 사용하여 상층액을 가능한 한 많이 제거하였다. 800 마이크로리터의 양으로, 핵 세척 완충액을 첨가하였다. 그리고 튜브를 부드럽게 반전시켜 핵을 재현탁시켰다.
튜브를 섭씨 4도에서 4분 동안 300rcf로 다시 회전시켰다. 총 3번의 세척 후, 생성된 핵을 신선한 1.5 밀리리터 원심분리 튜브에서 합하고, 섭씨 4도에서 4분 동안 300 rcf에서 회전시켰다. 피펫 팁을 사용하여 나머지 버퍼를 가능한 한 많이 제거했습니다.
다음 단계는 항체의 인큐베이션이었다. 50 마이크로리터의 핵의 분취량을 디지토닌 중의 EDTA, BSA, 프로테아제 억제제 칵테일로 보충된 1 밀리리터의 항체 완충액에 재현탁시켰다. 핵 현탁액의 150 마이크로리터의 분취량을 하나의 반응을 위해 신선한 1.5 밀리리터 튜브에 넣고, 두 마이크로리터의 항체를 각 튜브에 첨가하였다.
이 분석에서, 항히스톤-H3-라이신-4-트리메틸화 항체 및 면역글로불린 G 음성 대조군에 대한 두 개의 생물학적 복제물을 항체가 첨가된 후에 설정하였다. 용액을 부드럽게 혼합하고, 튜브를 12 rpm에서 섭씨 네 도에서 하룻밤 동안 혼성화를 위해 수평 진탕기 상에 방치하였다. 다음날 아침, 튜브를 꺼내고 핵을 800 마이크로리터의 면역 침전 세척 완충액을 사용하여 세척하였다.
튜브를 혼합을 위해 부드럽게 반전시키고, 실온에서 12 rpm으로 다섯 분 동안 수평 진탕기 상에 방치하였다. 세척 후, 튜브를 섭씨 네 도에서 네 분 동안 300 rcf에서 회전시켰다. 원심분리 후, 상층액을 피펫 팁을 사용하여 제거하였다.
이것은 총 세 번의 세척 동안 반복되었다. 세 번째 세척 후, 튜브를 섭씨 네 도에서 두 분 동안 300 rcf로 회전시키고, 피펫 팁을 사용하여 나머지 버퍼를 가능한 한 많이 제거하였다. 인큐베이션을 위한 Tn5 트랜스포자제 믹스를 제조하였다.
1 마이크로리터의 트랜스포자제를 트랜스포사제 인큐베이션 완충액의 각 150 마이크로리터에 첨가하였다. 우리는 반응의 수에 따라 먼저 트랜스포자제 용액 믹스를 준비하는 것이 좋습니다. 그런 다음 각 튜브에 150 마이크로리터의 분취량을 첨가한다.
용액을 부드럽게 혼합하고, 2시간 동안 실온에서 12 rpm의 수평 진탕기 상에 방치하였다. 튜브를 10 내지 15분마다 부드럽게 혼합하였다. 인큐베이션 후, 핵을 실온에서 800 마이크로리터의 면역침전 세척 완충액을 사용하여 세 번 세척하여 결합되지 않은 Tn5 트랜스포자제를 제거하였다.
세 번째 세척 후, 튜브를 섭씨 네 도에서 두 분 동안 300 rcf에서 회전시키고, 피펫 팁을 사용하여 나머지 완충액을 제거하였다. 태멘테이션 단계를 위해, 300 마이크로리터의 태멘테이션 버퍼를 반응 튜브에 첨가하였다. 용액을 잘 혼합하고 섭씨 37도에서 한 시간 동안 인큐베이션하였다.
10%SDS의 30 마이크로리터에서 리터당 0.5 몰의 EDTA를 10 마이크로리터로 인큐베이션한 후 반응을 확인하기 위해 첨가하였다. 다음으로 300 마이크로리터의 DNA 추출 완충액을 첨가하였다. 불규칙한 DNA 추출을 수행하였다.
DNA 단편을 25 마이크로리터의 멸균수에 용해시켰다. 24 마이크로리터를 NGS 라이브러리 구축에서 PCR 증폭에 사용하였다. 이 그림은 현미경으로 이미지화 된 DAPI로 손상되지 않은 핵 염색을 보여 주며 적절한 양의 손상되지 않고 비교적 깨끗한 핵을 얻는 것이 CUT & Tag의 중요한 단계입니다.
PCR 후, 두 마이크로리터를 옮기고 1.5% 아가로스 겔에서 DNA의 크기를 검사하였다. 이 그림은 면역글로불린 유전자가 음성 대조군과 비교된다는 것을 보여준다. 히스톤 H3 라이신 4 트리메틸화 샘플로부터의 DNA 단편의 대부분은 280 내지 500 염기쌍 범위이어야 한다.
DNA 단편은 정제될 수 있고, 이어서 높은 처리량 시퀀싱에 의해 프로파일링될 수 있다. 이 도면은 면역글로불린 G 음성 대조군과 비교하여 항히스톤 H3 라이신4 트리메틸화 항체에 대한 시퀀싱 생성 결과를 나타낸 것이다. 이 기술은 ChIP-seq와 비교하여 단순화 된 절차로 소수의 세포를 사용하여 고해상도 및 예외적으로 낮은 배경으로 DNA 라이브러리를 생성합니다.
CUT&Tag는 새로운 방법이며 아직 진행 중입니다.
