O objetivo geral do experimento foi identificar fragmentos de DNA afiliados à proteína em todo o genoma, o que refletiu o status da cromatina. Para atingir esse objetivo, foram realizadas três operações especiais. Em primeiro lugar, os núcleos intactos das células vegetais foram isolados.
Em segundo lugar, as modificações na cromatina foram reconhecidas por um anticorpo específico in situ. Em terceiro lugar, o anticorpo amarrando uma proteína de fusão de transposase, transposase Tn5, cutucar a cromatina in situ sob a ativação de íons de magnésio. Os fragmentos de DNA e os locais de ligação da modificação da cromatina foram então integrados com adaptadores e prontos para a preparação do DNA.
O enriquecimento de reação em cadeia de polimerase melhorou o sequenciamento da geração. A regulação epigenômica no nível cromático, incluindo modificações de DNA e histona, comportamentos de fatores de transcrição e RNAs não codificantes com suas proteínas recrutadas, levam ao controle temporal e espacial da expressão genética. A tecnologia CUT&Tag desenvolvida pela Henikoff Lab é um método de tethering de enzimas para perfil epigenômico de cromatina com alta eficiência.
Aqui empregamos as folhas de algodão como materiais experimentais, e para realizar o perfil de cromatina usando anticorpo de Histone H3 Lysine-4 Trimetilação como exemplo. Fornecemos um protocolo refinado com vídeo para desempenho da CUT&Tag em plantas. Para cada preparação amostral utilizando CUT&Tag, foram coletados gramas de tecido de folha de algodão.
A folha foi moída em um pó fino com nitrogênio líquido, e transferida para um tubo falcão de 50 mL contendo 25 mL de tampão de isolamento nuclear refrigerado A.A solução tampão foi misturada suavemente, e o tubo foi incubado no gelo por cinco minutos com suave agitação para dispersar o material uniformemente. Foi então girado a 500 relativas da força centrífuga ou rcf, a 4 graus Celsius, por cinco minutos, para formar a pelota celular. O supernante foi decantado e a pelota foi resuspended com 20 mL de tampão de isolamento nuclear refrigerado B, complementado com 0,5% Triton.
O tubo foi invertido suavemente para resuspensar a pelota completamente. O liseto celular resultante foi então filtrado com uma combinação de duas peneiras, uma peneira de 500 malhas foi usada em cima para remover os detritos de tecido maiores. E uma peneira de 1000 malhas foi usada na parte inferior para coletar os núcleos.
A escolha do tamanho adequado da malha das peneiras depende do tamanho dos núcleos das plantas. O papel filtro estéril foi usado na parte de trás da peneira para absorver parte do lise e pequenos detritos celulares. O lysate contendo os núcleos foi transferido para um tubo de centrífuga fresco de 1,5 mililitros, e girou a 300 rcf por quatro minutos, a 4 graus Celsius graus Celsius para coletar os núcleos.
Após a centrifugação, uma ponta de pipeta foi usada para remover o máximo possível do supernante. Uma quantidade de 800 microliters, um tampão de lavagem nuclear foi adicionado. E o tubo foi invertido suavemente para resuspensar os núcleos.
O tubo foi girado novamente a 300 rcf, por quatro minutos a 4 graus Celsius. Após um total de três lavagens, os núcleos resultantes foram combinados em um tubo de centrífugas fresco de 1,5 mililitros, e girados a 300 rcf, por quatro minutos a 4 graus Celsius. Uma ponta de pipeta foi usada para remover o máximo possível do buffer restante.
O passo seguinte foi a incubação do anticorpo. Uma alíquota de 50 microliters de núcleos foi resuspended em 1 mililitro de tampão de anticorpos suplementado com EDTA, BSA, coquetel inibidor de protease em digitonina. Uma alíquota de 150 microlitres da suspensão dos núcleos foi colocada em um tubo fresco de 1,5 mililitro para uma reação, dois microliters de anticorpos foram adicionados a cada tubo.
Neste ensaio, duas réplicas biológicas para o anticorpo anti-histone-H3-Lysine-4-Trimethylation e grupos de controle negativos de imunoglobulina G foram criadas após a adição de anticorpos. A solução foi misturada suavemente, e os tubos foram deixados em um agitador horizontal para hibridização durante a noite a quatro graus Celsius em 12 rpm. Na manhã seguinte, os tubos foram retirados e os núcleos foram lavados usando 800 microliters de tampão de lavagem de imuno precipitação.
O tubo foi invertido suavemente para mistura e foi deixado no agitador horizontal por cinco minutos à temperatura ambiente em 12 rpm. Após a lavagem, o tubo foi girado a 300 rcf por quatro minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, o supernatante foi removido usando uma ponta de pipeta.
Isso se repetiu para um total de três lavagens. Após a terceira lavagem, o tubo foi girado a 300 rcf por dois minutos a quatro graus Celsius, e uma ponta de pipeta foi usada para remover o buffer restante o máximo possível. Para preparar a mistura de transposase Tn5 para incubação.
Um microliter de transposase foi adicionado a cada 150 microlitres do buffer de incubação transposase. Recomendamos preparar o mix de solução transposase primeiro de acordo com o número de reações. E, em seguida, adicionar uma alíquota de 150 microliters a cada tubo.
A solução foi misturada suavemente e deixada em um agitador horizontal à temperatura ambiente em 12 rpm por duas horas. Os tubos foram misturados suavemente a cada 10 a 15 minutos. Após a incubação, os núcleos foram lavados três vezes usando 800 microliters de tampão de lavagem de imuno precipitação à temperatura ambiente para remover a transposase Tn5 não ligada.
Após a terceira lavagem, o tubo foi girado a 300 rcf por dois minutos a quatro graus Celsius, e uma ponta de pipeta foi usada para remover o tampão restante. Para a etapa de tagmentação, 300 microliters de tampão de tagmentação foram adicionados ao tubo de reação. A solução foi bem misturada e incubada a 37 graus Celsius por uma hora.
Após a incubação foram adicionados 10 microliters de 0,5 mol por litro EDTA a 30 microliters de 10% SDS para determinar a reação. Os próximos 300 microliters de tampão de extração de DNA foram adicionados. Foi realizada extração irregular de DNA.
Os fragmentos de DNA foram dissolvidos em 25 microlitres de água estéril. Foram utilizados 24 microliters para amplificação de PCR na construção de bibliotecas NGS. Esta figura mostra a mancha de núcleos intactos com DAPI em imagem, sob um microscópio obter uma quantidade adequada de núcleos intactos e relativamente limpos é o passo crítico para a CUT&Tag.
Após a PCR, dois microlitres foram transferidos e o tamanho do DNA foi verificado em gel de 1,5%. Este número mostra que se compara com o controle negativo do gene da imunoglobulina. A maior parte dos fragmentos de DNA da amostra de Lysina 4 De Lysina 4 de Histone h3 deve variar de 280 a 500 pares de base.
Os fragmentos de DNA podem ser purificados e, em seguida, perfilados por sequenciamento de alto rendimento. Este número mostra o sequenciamento de geração de resultados para o anticorpo anti-histone H3 Lysine 4 Trimetilação comparar com os grupos de controle negativos da imunoglobulina G. Esta tecnologia gera as bibliotecas de DNA em alta resolução e fundo excepcionalmente baixo usando um pequeno número de células com um procedimento simplificado em comparação com chip-seq.
CUT&Tag é um novo método e ainda está em andamento.
