Deneyin genel amacı, kromatinin durumunu yansıtan genom boyunca proteine bağlı DNA fragmanlarını tanımlamaktı. Bu amaca ulaşmak için üç özel operasyon gerçekleştirildi. Her şeyden önce, bitki hücrelerinden gelen bozulmamış çekirdekler izole edildi.
İkincisi, kromatin modifikasyonları in situ spesifik bir antikor tarafından tanındı. Üçüncüsü, bir protein A-transpozaz füzyon proteini olan Tn5 transpozazı bağlayan antikor, magnezyum iyonlarının aktivasyonu altında kromatini in situ olarak parçalar. DNA fragmanları ve kromatin modifikasyonu bağlanma bölgeleri daha sonra adaptörlerle entegre edildi ve DNA hazırlığı için hazır hale getirildi.
Polimeraz zincir reaksiyonu zenginleştirmesi, nesil dizilimini arttırdı. DNA ve histon modifikasyonları, transkripsiyon faktörlerinin davranışları ve işe alınan proteinleriyle kodlamayan RNA'lar dahil olmak üzere kromatik düzeyde epigenomik düzenleme, gen ekspresyonunun zamansal ve mekansal kontrolüne yol açar. Henikoff Lab tarafından geliştirilen CUT&Tag teknolojisi, kromatin epigenomik profillemesi için yüksek verimlilikte bir enzim bağlama yöntemidir.
Burada pamuk yapraklarını deney malzemeleri olarak kullanıyoruz ve örnek olarak Histone H3 Lysine-4 Trimethylation antikoru kullanarak kromatin profillemesini gerçekleştiriyoruz. Tesislerde CUT&Tag performansı için video içeren rafine bir protokol sunuyoruz. CUT&Tag kullanılarak yapılan her numune hazırlığı için gram pamuklu yaprak dokusu toplandı.
Yaprak, sıvı azotlu ince bir toz haline getirildi ve 25 mL soğutulmuş nükleer izolasyon tamponu içeren 50 mL'lik bir şahin tüpüne aktarıldı A.Tampon çözeltisi yavaşça karıştırıldı ve tüp, malzemeyi eşit şekilde dağıtmak için hafifçe sallanarak beş dakika boyunca buz üzerinde inkübe edildi. Daha sonra hücre peletini oluşturmak için beş dakika boyunca 500 göreceli merkezkaç kuvvetinde veya rcf'de, 4 santigrat derecede döndürüldü. Süpernatant boşaltıldı ve pelet 20 mL soğutulmuş nükleer izolasyon tamponu B ile% 0.5 Triton ile desteklenerek yeniden askıya alındı.
Pelet tamamen askıya almak için tüp hafifçe ters çevrildi. Elde edilen hücre lizatı daha sonra iki elek kombinasyonu ile filtrelendi, daha büyük doku kalıntılarını çıkarmak için üstte 500 mesh elek kullanıldı. Çekirdekleri toplamak için altta 1000 mesh elek kullanıldı.
Eleklerin uygun ağ boyutunun seçimi, bitkilerin çekirdeklerinin büyüklüğüne bağlıdır. Lizatın bir kısmını ve küçük hücre kalıntılarını emmek için eleğin arka tarafında steril filtre kağıdı kullanılmıştır. Çekirdekleri içeren lizat, taze bir 1.5 mililitre santrifüj tüpüne aktarıldı ve çekirdekleri toplamak için dört dakika boyunca 300 rcf'de, 4 santigrat derece santigrat derecede döndürüldü.
Santrifüjlemeden sonra, süpernatantın mümkün olduğunca çoğunu çıkarmak için bir pipet ucu kullanıldı. 800 mikrolitrelik bir miktar, bir nükleer yıkama tamponu eklendi. Ve tüp, çekirdekleri yeniden askıya almak için hafifçe ters çevrildi.
Tüp tekrar 300 rcf'de, dört dakika boyunca 4 santigrat derecede döndürüldü. Toplam üç yıkamadan sonra, elde edilen çekirdekler taze bir 1.5 mililitre santrifüj tüpünde birleştirildi ve 4 santigrat derecede dört dakika boyunca 300 rcf'de döndürüldü. Kalan tamponu mümkün olduğunca çıkarmak için bir pipet ucu kullanıldı.
Bir sonraki adım, antikorun inkübasyonuydu. 50 mikrolitre çekirdekten oluşan bir alikot, digitonin içinde EDTA, BSA, proteaz inhibitörü kokteyli ile desteklenmiş 1 mililitre antikor tamponunda yeniden askıya alındı. Bir reaksiyon için 150 mikrolitrelik çekirdek süspansiyonunun bir alikotu taze 1.5 mililitrelik bir tüpe yerleştirildi, her tüpe iki mikrolitre antikor eklendi.
Bu tahlilde, antikor eklendikten sonra anti-histon-H3-Lizin-4-Trimetilasyon antikoru ve immünoglobulin G negatif kontrol grupları için iki biyolojik replikasyon oluşturulmuştur. Çözelti nazikçe karıştırıldı ve tüpler 12 rpm'de dört santigrat derecede gece boyunca hibridizasyon için yatay bir çalkalayıcı üzerinde bırakıldı. Ertesi sabah, tüpler çıkarıldı ve çekirdekler 800 mikrolitre immünosu çökeltme yıkama tamponu kullanılarak yıkandı.
Tüp karıştırmak için hafifçe ters çevrildi ve 12 rpm'de oda sıcaklığında beş dakika boyunca yatay çalkalayıcıda bırakıldı. Yıkandıktan sonra, tüp dört santigrat derecede dört dakika boyunca 300 rcf'de döndürüldü. Santrifüjlemeden sonra, süpernatant bir pipet ucu kullanılarak çıkarıldı.
Bu toplam üç yıkama için tekrarlandı. Üçüncü yıkamadan sonra, tüp dört santigrat derecede iki dakika boyunca 300 rcf döndürüldü ve kalan tamponu mümkün olduğunca çıkarmak için bir pipet ucu kullanıldı. Tn5 transpozaz karışımını inkübasyon için hazırlamak.
Transpozaz inkübasyon tamponunun her 150 mikrolitresine bir mikrolitre transpozaz eklendi. Transpozaz çözeltisi karışımını önce reaksiyon sayısına göre hazırlamanızı öneririz. Ve sonra her tüpe 150 mikrolitrelik bir aliquot eklemek.
Çözelti hafifçe karıştırıldı ve iki saat boyunca 12 rpm'de oda sıcaklığında yatay bir çalkalayıcı üzerinde bırakıldı. Tüpler her 10 ila 15 dakikada bir nazikçe karıştırıldı. Kuluçkadan sonra, çekirdekler, bağlanmamış Tn5 transpozazı çıkarmak için oda sıcaklığında 800 mikrolitre immüno-çökeltme yıkama tamponu kullanılarak üç kez yıkandı.
Üçüncü yıkamadan sonra, tüp dört santigrat derecede iki dakika boyunca 300 rcf'de döndürüldü ve kalan tamponu çıkarmak için bir pipet ucu kullanıldı. Etiketleme adımı için, reaksiyon tüpüne 300 mikrolitre etiketleme tamponu eklendi. Çözelti iyice karıştırıldı ve bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edildi.
Kuluçkadan sonra, reaksiyonu belirlemek için 30 mikrolitre% 10 SDS'de litre başına 10 mikrolitre 0.5 mol EDTA ilave edildi. Daha sonra 300 mikrolitre DNA ekstraksiyon tamponu eklendi. Düzensiz DNA ekstraksiyonu yapıldı.
DNA parçaları 25 mikrolitre steril suda çözüldü. NGS kütüphane yapımında PCR amplifikasyonu için 24 mikrolitre kullanıldı. Bu şekil, görüntüde DAPI ile bozulmamış çekirdek boyasını göstermektedir, mikroskop altında yeterli miktarda bozulmamış ve nispeten temiz çekirdek elde etmek CUT & Tag için kritik adımdır.
PCR'den sonra iki mikrolitre transfer edildi ve DNA'nın boyutu% 1.5 agaroz jeli üzerinde kontrol edildi. Bu şekil immünoglobulin geninin negatif kontrolü ile karşılaştırıldığını göstermektedir. Histon H3 Lizin 4 Trimetilasyon örneğinden DNA fragmanlarının büyük kısmı 280 ila 500 baz çifti arasında değişmelidir.
DNA fragmanları saflaştırılabilir ve daha sonra yüksek verimli dizileme ile profillenebilir. Bu şekil, anti-histon H3 Lizin 4 Trimetilasyon antikoru için immünoglobulin G negatif kontrol gruplarıyla karşılaştırıldığında sonuç üretme dizilimini göstermektedir. Bu teknoloji, ChIP-seq ile karşılaştırıldığında basitleştirilmiş bir prosedürle az sayıda hücre kullanarak DNA kütüphanelerini yüksek çözünürlükte ve son derece düşük arka planda oluşturur.
CUT&Tag yeni bir yöntemdir ve hala devam etmektedir.
