Das übergeordnete Ziel des Experiments war es, proteinassoziierte DNA-Fragmente im gesamten Genom zu identifizieren, die den Status des Chromatins widerspiegelten. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden drei Spezialoperationen durchgeführt. Zunächst wurden die intakten Kerne von Pflanzenzellen isoliert.
Zweitens wurden Modifikationen des Chromatins durch einen spezifischen Antikörper in situ erkannt. Drittens spaltet der Antikörper, der ein Protein-A-Transposase-Fusionsprotein, Tn5-Transposase, bindet, das Chromatin in situ unter der Aktivierung von Magnesiumionen. Die DNA-Fragmente und Chromatinmodifikations-Bindungsstellen wurden dann mit Adaptern integriert und für die DNA-Präparation vorbereitet.
Polymerase-Kettenreaktionsanreicherung verbesserte die Sequenzierung der Erzeugung. Die Regulation der Epigenomik auf chromatischer Ebene, einschließlich DNA- und Histonmodifikationen, Verhalten von Transkriptionsfaktoren und nicht-kodierenden RNAs mit ihren rekrutierten Proteinen, führt zu einer zeitlichen und räumlichen Kontrolle der Genexpression. Die von Henikoff Lab entwickelte CUT&Tag-Technologie ist eine Enzym-Tethering-Methode für die Chromatin-Epigenomik-Profilierung mit hoher Effizienz.
Hier verwenden wir die Baumwollblätter als experimentelle Materialien und führen die Chromatinprofilierung am Beispiel des Antikörpers der Histon-H3-Lysin-4-Trimethylierung durch. Wir bieten ein verfeinertes Protokoll mit Video für die CUT & Tag-Leistung in Anlagen. Für jede Probenvorbereitung mit CUT&Tag wurden Gramm Baumwollblattgewebe gesammelt.
Das Blatt wurde zu einem feinen Pulver mit flüssigem Stickstoff gemahlen und in ein 50 ml Falkenröhrchen mit 25 ml gekühltem Kernisolationspuffer A überführt.Die Pufferlösung wurde vorsichtig gemischt, und das Rohr wurde fünf Minuten lang mit sanftem Schütteln auf Eis inkubiert, um das Material gleichmäßig zu dispergieren. Es wurde dann bei 500 relativer Zentrifugalkraft oder rcf, bei 4 Grad Celsius, für fünf Minuten gedreht, um das Zellpellet zu bilden. Der Überstand wurde dekantiert und das Pellet wurde mit 20 ml gekühltem nuklearem Isolationspuffer B resuspendiert, ergänzt durch 0,5% Triton.
Das Rohr wurde sanft invertiert, um das Pellet vollständig zu resuspendieren. Das resultierende Zelllysat wurde dann mit einer Kombination von zwei Sieben filtriert, ein 500-mesh-Sieb wurde oben verwendet, um die größeren Gewebeablagerungen zu entfernen. Und ein 1000-Mesh-Sieb wurde auf der Unterseite verwendet, um die Kerne zu sammeln.
Die Wahl der geeigneten Maschenweite der Siebe hängt von der Größe der Kerne der Pflanzen ab. Auf der Rückseite des Siebes wurde steriles Filterpapier verwendet, um einen Teil des Lysats und kleinzelligen Ablagerungen zu absorbieren. Das Lysat, das die Kerne enthielt, wurde in ein frisches 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt und vier Minuten lang bei 300 rcf bei 4 Grad Celsius Celsius gedreht, um die Kerne zu sammeln.
Nach der Zentrifugation wurde eine Pipettenspitze verwendet, um so viel wie möglich vom Überstand zu entfernen. Eine Menge von 800 Mikrolitern, ein nuklearer Waschpuffer wurde hinzugefügt. Und die Röhre wurde sanft invertiert, um die Kerne wieder aufzuhängen.
Die Röhre wurde bei 300 rcf erneut gedreht, vier Minuten lang bei 4 Grad Celsius. Nach insgesamt drei Wäschen wurden die resultierenden Kerne in einem frischen 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zusammengefügt und bei 300 rcf für vier Minuten bei 4 Grad Celsius gedreht. Eine Pipettenspitze wurde verwendet, um den verbleibenden Puffer so weit wie möglich zu entfernen.
Der nächste Schritt war die Inkubation des Antikörpers. Ein Aliquot von 50 Mikrolitern Kernen wurde in 1 Milliliter Antikörperpuffer resuspendiert, ergänzt mit EDTA, BSA, Proteaseinhibitor-Cocktail in Digitonin. Ein Aliquot von 150 Mikrolitern der Kernsuspension wurde für eine Reaktion in ein frisches 1,5-Milliliter-Röhrchen gegeben, zwei Mikroliter Antikörper wurden zu jeder Tube gegeben.
In diesem Assay wurden zwei biologische Replikate für die Anti-Histon-H3-Lysin-4-Trimethylierungs-Antikörper- und Immunglobulin-G-Negativkontrollgruppen nach der Zugabe von Antikörpern eingerichtet. Die Lösung wurde schonend gemischt, und die Rohre wurden auf einem horizontalen Shaker für die Hybridisierung über Nacht bei vier Grad Celsius in 12 U / min belassen. Am nächsten Morgen wurden die Röhrchen herausgenommen und die Kerne mit 800 Mikrolitern Immunfällungswaschpuffer gewaschen.
Das Rohr wurde zum Mischen sanft invertiert und fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 12 U / min auf dem horizontalen Schüttler belassen. Nach dem Waschen wurde das Rohr bei 300 rcf für vier Minuten bei vier Grad Celsius gedreht. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand mit einer Pipettenspitze entfernt.
Dies wurde für insgesamt drei Wäschen wiederholt. Nach der dritten Wäsche wurde das Rohr zwei Minuten lang bei vier Grad Celsius mit einem 300 rcf gesponnen, und eine Pipettenspitze wurde verwendet, um den verbleibenden Puffer so weit wie möglich zu entfernen. Zur Vorbereitung der Tn5-Transposasemischung für die Inkubation.
Ein Mikroliter Transposase wurde zu je 150 Mikrolitern des Transposase-Inkubationspuffers hinzugefügt. Wir empfehlen, die Transposase-Lösungsmischung zuerst entsprechend der Anzahl der Reaktionen zuzubereiten. Und dann ein Aliquot von 150 Mikrolitern zu jeder Röhre hinzufügen.
Die Lösung wurde vorsichtig gemischt und zwei Stunden lang bei Raumtemperatur bei 12 U / min auf einem horizontalen Schüttler belassen. Die Röhrchen wurden alle 10 bis 15 Minuten vorsichtig gemischt. Nach der Inkubation wurden die Kerne dreimal mit 800 Mikrolitern Immunfällungswaschpuffer bei Raumtemperatur gewaschen, um die ungebundene Tn5-Transposase zu entfernen.
Nach der dritten Wäsche wurde das Rohr bei 300 rcf für zwei Minuten bei vier Grad Celsius gedreht, und eine Pipettenspitze wurde verwendet, um den verbleibenden Puffer zu entfernen. Für den Tagmentationsschritt wurden 300 Mikroliter Tagmentationspuffer in das Reaktionsrohr gegeben. Die Lösung wurde gut gemischt und bei 37 Grad Celsius für eine Stunde inkubiert.
Nach der Inkubation wurden 10 Mikroliter von 0,5 Mol pro Liter EDTA bei 30 Mikrolitern von 10% SDS hinzugefügt, um die Reaktion zu bestimmen. Die nächsten 300 Mikroliter DNA-Extraktionspuffer wurden hinzugefügt. Es wurde eine unregelmäßige DNA-Extraktion durchgeführt.
Die DNA-Fragmente wurden in 25 Mikrolitern sterilem Wasser gelöst. 24 Mikroliter wurden für die PCR-Amplifikation im NGS-Bibliotheksbau verwendet. Diese Abbildung zeigt den intakten Kernfleck mit DAPI in der Abbildung, unter einem Mikroskop eine ausreichende Menge an intakten und relativ sauberen Kernen zu erhalten, ist der kritische Schritt für CUT & Tag.
Nach der PCR wurden zwei Mikroliter übertragen und die Größe der DNA auf 1,5%Agarosegel überprüft. Diese Abbildung zeigt, dass sie mit der Immunglobulin-Gen-Negativkontrolle verglichen wird. Der Großteil der DNA-Fragmente aus der Histone H3 Lysine 4 Trimethylierungsprobe sollte zwischen 280 und 500 Basenpaaren liegen.
Die DNA-Fragmente können gereinigt und dann durch Hochdurchsatz-Sequenzierung profiliert werden. Diese Abbildung zeigt die Ergebnisse der Generierungssequenzierung für den Antihiston H3 Lysine 4 Trimethylierung Antikörper im Vergleich zu den Immunglobulin G Negativkontrollgruppen. Diese Technologie generiert die DNA-Bibliotheken mit hoher Auflösung und außergewöhnlich niedrigem Hintergrund unter Verwendung einer kleinen Anzahl von Zellen mit einem vereinfachten Verfahren im Vergleich zu ChIP-seq.
CUT&Tag ist eine neue Methode und noch in Arbeit.
