ينطبق هذا البروتوكول على دراسة داء الكبد وكذلك على مسارات الكبد والأيض والاصطناعية والتحميض في سياق داء الستاتوسيس. والمزايا الرئيسية لهذه الطريقة هي إمكانية إعادة إنتاجها والوقت القصير اللازم للحصول على نتائج. إضافة في حقيقة أنه يقدم مستويين من steatosis، خفيفة، وشديدة.
قد يوفر داء الستاتوسيس المستحث في المختبر دليلا لتحديد العلامات المحتملة لتشخيص المرض ، وكذلك الأهداف العلاجية. والمقصود من هذا الأسلوب ليتم تطبيقها في نتيجة steatosis. ومع ذلك، يمكن تعديله إلى مجموعة واسعة من الخلايا المختلفة المتضررة من الإفراط في التعرض للدهون، كما هو الحال أثناء السمنة والدهون.
إعداد معيار RPMI 1640. ملحق RPMI 1640 ثقافة المتوسطة مع 10٪ من الحرارة تفعيلها FBS، و 1٪ من محلول العقدية البنسلين. تعقيمه باستخدام مرشحات 0.22 ميكرومتر وتخزين الملحق في أربع درجات مئوية.
لإعداد محلول مخزون بالميتات إعداد حل 50 ملليمولار من البالميتات في RPMI 1640 القياسية تكملها مع 1٪ من BSA خالية من الدهون. تعقيم حوالي خمسة إلى عشرة ملليلترات من محلول المخزون باستخدام مرشحات 0.22 ميكرومتر وتخزينها في أربع درجات مئوية محمية من الضوء لمدة تصل إلى شهر واحد. لإعداد حل مخزون oleate تحضير حل 50 ملليمولار من oleate في RPMI 1640 المكمل.
وتعقيم محلول المخزون باستخدام مرشحات 0.22 ميكرومتر. تخزينه في ناقص 20 درجة مئوية، محمية من الضوء لمدة تصل إلى شهر واحد. لإعداد المتوسطة steatogenic من المخزونات المعدة سابقا، وإعداد 100 ملليمتر من مزيج 50 ميكرومولار من جزء واحد بالميتات واثنين من أوليات جزء.
لمستويات خفيفة، صب مزيج 500 ميكرومولار من جزء واحد بالميتات واثنين من أوليات جزء لمستويات شديدة في معيار RPMI 1640. وتعقيم باستخدام مرشحات 0.22 ميكرومتر. يخزن عند درجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
بدلا من ذلك، لإعداد حلول الأسهم مع الأحماض الدهنية المعنية باستخدام الزلال الدهون الحرة، حل إما بالميتات أو الأوليات في اثنين من ملليلتر من الإيثانول المطلق ومن ثم مزيج في الحجم النهائي من RPMI القياسية 1640. حل oleate مباشرة عن طريق تخزين في معيار RPMI 1640 ثقافة المتوسطة. السماح بتبخر الإيثانول عن طريق احتضان في حمام مائي في 70 درجة مئوية وتخلط جيدا.
قم بتعقيم كل من حلول المخزون باستخدام مرشحات 0.22 ميكرومتر وتخزين محلول مخزون البالميتات عند أربع درجات مئوية. وحل مخزون الأوليات عند ناقص 20 درجة مئوية. مقعد 0.1 مليون خلايا Hep G2 لكل بئر في لوحة 24 جيدا.
إضافة ملليلتر واحد من RPMI القياسية 1640. قبل الحضانة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة، مما يسمح بتعلق الخلية. بعد الثقافة المسبقة، تجاهل المتوسط RPMI 1640 القياسية.
وإضافة الوسط السخونة. تجاهل supernatant وإضافة وسيطة steatogenic الطازجة كل 24 ساعة. لإجراء تقييم الجدوى والمورفولوجيا، تجاهل الخلايا الفائقة وفصل من البئر بإضافة 500 ميكرولتر من 0.05٪ تريبسين EDTA.
احتضان لمدة خمس دقائق في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. جمع الخلايا التي أعيد إنفاقها في أنبوب صغير. والطرد المركزي في 300 مرة G.Then تجاهل supernatant، إضافة 200 ميكرولتر من RPMI القياسية 1640، وإعادة إنفاق الخلايا.
إضافة 15 ميكرولتر من 0.4٪ من الحل الأزرق تريبان في أنبوب صغير الطازجة. إضافة وخلط 15 ميكرولتر من تعليق الخلية السابقة. عد الخلايا الملطخة وغير الملطخة في مقياس الدم وحساب معدلات البقاء والوفيات.
ضع غطاء ثقافة الخلية في كل بئر في لوحة من 24 بئرا وخلايا Hep G2 كما هو موضح في المخطوطة النصية. بعد الحضانة المناسبة، اغسل الخلايا بميليلتر واحد من برنامج تلفزيوني وتخلص من الناشرة الفائقة. مزجها مع ملليلتر واحد من 4٪ paraformaldehyde في برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
تجاهل paraformaldehyde الزائدة وشطف الخلايا مع ملليلتر واحد من الماء المقطر. ثم أضف ملليلتر واحد من 70٪ ايزوبروبانول واحتضان لمدة خمس دقائق. تجاهل الأيزوبروبانول الزائد وإضافة ملليلتر واحد من محلول الزيت والأحمر O واحتضان لمدة 30 دقيقة.
تجاهل محلول الزيت الأحمر الزائد، ثم اشطفه بميليلتر واحد من الماء المقطر. مراقبة الخلايا تحت المجهر في التكبير من 400x. اختيار والتقاط الصور عشوائيا من 10 حقول بصرية من منطقة كاملة من البئر.
كرر التصوير لكل بئر. لتقييم النسبة المئوية للمساحة الحمراء الملطخة، افتح برنامج ImageJ واستورد الملفات المطلوبة، ثم انقر على ضبط واستخدام عتبة اللون" أداة، وتحديد المعلمة هوى للكشف عن اللون الأحمر. ثم ضبط التشبع والسطوع للصورة.
قارن المنطقة الملطخة مع المساحة الكاملة للحقل البصري ، وذلك باستخدام أداة تحليل الجسيمات "وحساب متوسط النسبة المئوية لكل بئر. الجلوس 0.1 مليون خلايا الكبد لكل بئر في لوحات 24 بئر يوفر التقاء الأمثل. تضاءلت الجدوى تدريجيا مع زيادة وقت الثقافة ، لتصل إلى أدنى مستوى لها وهو 60٪ في أربعة أيام في حالة الإصابة بالداء النتني الشديد.
وبناء على ذلك، كان معدل الوفيات أعلى في خلايا الكبد المستزرعة في الظروف السمية. وازداد تدريجيا مع وقت التعرض للدهون. وازدادت أعداد الخلايا تدريجيا نتيجة للانتشار.
ومع ذلك، كان معدل الانتشار أقل في الداء النتني المعتدل في ثلاثة وأربعة أيام. وعلى النقيض من ذلك، ارتبط الداء النتني الحاد بانخفاض الانتشار بمقدار 24 ساعة. أظهرت خلايا تلطيخ مع النفط الأحمر O زيادة مرتين على الأقل من قطرات الدهون في الخلايا المستزرعة في ظل ظروف steatogenic.
زادت الدهون داخل الخلايا وفقا لوقت التعرض للثقافة في الوسط ال steatogenic. في الداء النتني الخفيف ، تم زيادة محتويات الدهون من اليوم الثاني ، في حين أنها كانت عالية بشكل كبير في حالة الداء الدهني الحاد بدءا من 24 ساعة. تتطلب ثقافة الخلية خبرة سابقة.
يمكن أن يكون زراعة خلايا Hep G2 في حالة قياسية قبل استخدام هذا البروتوكول مفيدا. إعداد مخزون الأحماض الدهنية هو أيضا نقطة حاسمة. حمض بالميتيك صلب في درجة حرارة الغرفة، ويحتاج إلى تسخينه قبل إدارته.
وينبغي أن تسمح هذه الطريقة التحليل الجزيئي للمسارات المختلفة، بما في ذلك، على سبيل المثال لا الحصر، الانتشار، موت الخلايا المبرمج، الأوتوفاجيا، الإجهاد التأكسدي والتحليل الدوائي والسموم.
