Bu protokol karaciğer steatozu çalışmasının yanı sıra steatoz bağlamında hepatik, metabolik, sentetik ve toksifikasyon yolları için de geçerlidir. Bu yöntemin temel avantajları tekrarlanabilirliği ve sonuç almak için gereken kısa süredir. Hafif ve şiddetli olmak üzere iki steatoz seviyesi sunduğunu da ekleyin.
İn vitro indüklenen steatoz, hastalığın tanısı için potansiyel belirteçlerin ve terapötik hedeflerin tanımlanması için kanıt sağlayabilir. Bu yöntem steatoz sonucuna uygulanmalıdır. Bununla birlikte, obezite ve lipidemia sırasında olduğu gibi lipid aşırı maruziyetlerinden etkilenen çok çeşitli farklı hücrelere ayarlanabilir.
Standart RPMI 1640'ı hazırlayın. Takviye RPMI 1640 kültür ortamı ısı aktif FBS% 10 ve penisilin streptomisin çözeltisinin% 1 ile. 0,22 mikrometre filtre kullanarak sterilize edin ve takviyeyi dört santigrat derecede saklayın.
Palmitat stok çözeltisi hazırlamak için, lipid içermeyen BSA'nın% 1'i ile desteklenmiş standart RPMI 1640'ta 50 milimolar bir palmitat çözeltisi hazırlayın. 0,22 mikrometre filtre kullanarak stok çözeltisinin yaklaşık beş ila on mililitresini sterilize edin ve bir aya kadar ışıktan korunan dört santigrat derecede saklayın. Oleat stok çözeltisi hazırlamak için, ekli RPMI 1640'ta 50 milimolar bir oleat çözeltisi hazırlayın.
Ve 0,22 mikrometre filtre kullanarak stok çözeltisini sterilize edin. Bir aya kadar ışıktan korunarak eksi 20 santigrat derecede saklayın. Daha önce hazırlanmış stoklardan steatojenik ortam hazırlamak için, bir parça palmitat ve iki parça oleattan oluşan 50 mikromolar bir karışımın 100 milimetresini hazırlayın.
Hafif seviyeler için, standart RPMI 1640'ta ciddi seviyeler için bir parça palmitat ve iki parça oleatın 500 mikromolar karışımını dökün. Ve 0.22 mikrometre filtre kullanarak sterilize edin. Bir haftaya kadar dört santigrat derecede saklayın.
Alternatif olarak, serbest lipid albümin kullanarak ilgili yağ asitleri ile stok çözeltileri hazırlamak için, palmitat veya oleat iki mililitre mutlak etanol içinde çözün ve ardından standart RPMI 1640'ın son hacminde karıştırın. Standart RPMI 1640 kültür ortamında depolayarak oleat'ı doğrudan çözün. 70 santigrat derecede bir su banyosunda kuluçkaya yatırarak etanol buharlaşmasına izin verin ve iyice karıştırın.
Her iki stok solüsyonunu da 0,22 mikrometre filtresi kullanarak sterilize edin ve palmitat stok çözeltisini dört santigrat derecede saklayın. Ve eksi 20 santigrat derecede stok çözeltisi. 24 kuyulu bir tabakta kuyu başına 0,1 milyon Hep G2 hücresi oturt.
Bir mililitre standart RPMI 1640 ekleyin. 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 24 saat boyunca kuluçkaya yatırarak hücre bağlanmasına izin verin. Kültür öncesi sonra, standart RPMI 1640 ortamını atın.
Ve steatojenik ortamı ekleyin. Süpernatant atın ve her 24 saatte bir taze bir steatojenik ortam ekleyin. Canlılık ve morfoloji değerlendirmesi yapmak için, %0,05 trypsin EDTA'nın 500 mikrolitresini ekleyerek süpernatant ve deklare hücrelerini kuyudan atın.
37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitte beş dakika kuluçkaya yatır. Yeniden dirilen hücreleri bir mikro tüpte toplayın. Ve 300 kez Santrifüj G.Sonra süpernatant atın, standart RPMI 1640 bir 200 mikrolitre ekleyin ve hücreleri yeniden biriktirin.
Taze bir mikro tüpe 15 mikrolitre trypan mavi çözeltisinin% 0.4'ünü ekleyin. Önceki hücre süspansiyonunun 15 mikrolitresini ekleyin ve karıştırın. Hemositometredeki lekeli ve lekesiz hücreleri sayın ve canlılık ve mortalite oranlarını hesaplayın.
Metin el yazmasında açıklandığı gibi, 24 kuyulu bir tabaktaki her kuyuya bir hücre kültürü kapak kayması koyun ve Hep G2 hücrelerini tohumla. Uygun inkübasyondan sonra, hücreleri bir mililitre PBS ile yıkayın ve üst kısmı atın. PBS'de bir mililitre% 4 paraformaldehit ile karıştırın ve oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın.
Fazla paraformaldehit atın ve hücreleri bir mililitre damıtılmış su ile durulayın. Daha sonra% 70 izopropanol bir mililitre ekleyin ve beş dakika kuluçkaya yatırın. Fazla izopropanol atın ve bir mililitre Oil-Red O çözeltisi ekleyin ve 30 dakika kuluçkaya yatırın.
Fazla Yağ-Kırmızı O çözeltisini atın ve ardından bir mililitre damıtılmış su ile durulayın. Mikroskop altındaki hücreleri 400x büyütmede gözlemleyin. Kuyunun tüm alanından 10 optik alanın fotoğraflarını rastgele seçin ve yakalayın.
Her kuyu için görüntülemeyi tekrarlayın. Kırmızı lekeli alanın yüzdesini değerlendirmek için ImageJ yazılımını açın ve gerekli dosyaları içe aktarın, ardından renk eşiğini ayarlama ve kullanma"aracına tıklayın, kırmızı renk algılama için ton parametresini tanımlayın. Ardından görüntü için doygunluğu ve parlaklığı ayarlayın.
Analiz parçacıkları"aracını kullanarak lekeli alanı optik alanın tüm alanıyla karşılaştırın ve her kuyunun ortalama yüzdesini hesaplayın. 24 kuyulu plakalarda kuyu başına 0,1 milyon hepatosit oturma optimum izdiham sağlar. Kültürün zamanı arttıkça canlılık giderek azaldı ve şiddetli steatozda dört günde% 60'ın en düşüğüne ulaştı.
Buna göre steatojenik koşullarda kültüre edilen hepatositlerde mortalite oranı daha yüksekti. Ve lipitlere maruz kalma süresi ile giderek arttı. Çoğalma sonucu hücre sayıları giderek artmıştır.
Ancak hafif steatozda üç ve dört günde çoğalma oranı daha düşüktü. Buna karşılık, şiddetli steatoz 24 saat daha düşük çoğalma ile ilişkiliydi. Yağ-Kırmızı O ile boyama hücreleri, steatojenik koşullar altında kültürlenen hücrelerde lipit damlacıklarında en az iki kat artış gösterdi.
Steatojenik ortamda kültürün maruz kalma zamanına göre hücre içi yağ artmıştır. Hafif steatozda lipit içeriği ikinci günden itibaren arttırılırken, şiddetli steatozda 24 saatten itibaren önemli ölçüde yüksekti. Hücre kültürü önceki deneyimi gerektirir.
Bu protokolü kullanmadan önce Hep G2 hücrelerini standart bir durumda kültleme yardımcı olabilir. Yağ asidi stoğunun hazırlanması da çok önemli bir noktadır. Palmitik asit oda sıcaklığında katıdır ve yönetiminden önce ısıtılması gerekir.
Bu yöntem, çoğalma, apoptoz, otofaji, oksidatif stres ve farmakolojik ve toksikolojik analiz dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere farklı yolların moleküler analizine izin vermelidir.
