このプロトコルは、肝性、代謝、合成、およびステアトーシスの文脈における毒素化経路の研究に適用可能である。この方法の主な利点は、その再現性と結果を得るために必要な短い時間です。それは、軽度、および重度の2つのレベルのステアトーシスを提供しているという事実を追加します。
インビトロ誘発性ステアトーシスは、疾患の診断のための潜在的なマーカーの同定のための証拠を提供するかもしれない, ならびに治療標的.この方法は、ステアトーシスの結果に適用されることを意図しています。しかし、肥満や脂質血症の間など、脂質過剰暴露の影響を受けるさまざまな細胞の広い範囲に調整することができる。
標準 RPMI 1640 を準備します。10%の熱活性化FBS、およびペニシリンストレプトマイシン溶液の1%を含むRPMI 1640培地を補う。0.22マイクロメートルフィルターを使用して滅菌し、摂氏4度でサプリメントを保存します。
パルミチンのストック溶液を調製するために、標準RPMI 1640にパルミテートの50ミリモル溶液を調製し、1%の脂質フリーBSAを補充した。0.22マイクロメートルフィルターを使用して約5〜10ミリリットルのストック液を殺菌し、最大1ヶ月間光から保護された摂氏4度で保管します。オレイン酸ストック溶液を調製するために、補充されたRPMI 1640にオレエートの50ミリモル溶液を調製する。
0.22マイクロメートルフィルターを使用して、ストック液を殺菌します。マイナス20度で保存し、最大1ヶ月間光から保護します。以前に調製した在庫からステアトラゲン培地を調製するには、パルミエート1部と2部のオレイン酸の50マイクロモルミックスの100ミリメートルを調製します。
穏やかなレベルの場合は、標準RPMI 1640の重度のレベルのためにパルミチン酸1つの部分と2つの部分オレエートの500マイクロモルミックスを注ぎます。0.22マイクロメートルフィルターを使用して滅菌します。摂氏4度で1週間まで保管してください。
あるいは、遊離脂質アルブミンを用いてそれぞれの脂肪酸を用いてストック溶液を調製し、パルミチンまたはオレ酸塩を2ミリリットルの絶対エタノールに溶解し、次いで標準RPMI 1640の最終体積に混合する。標準RPMI 1640培地に保存して直接オレ化を溶解する。摂氏70度の水浴でインキュベートしてエタノールの蒸発を可能にし、十分に混ぜます。
0.22マイクロメートルフィルターを使用して両方のストックソリューションを滅菌し、パルミテストック溶液を摂氏4度で保存します。そして、マイナス20°Cでストックソリューションをオレート。24ウェルプレートに1ウェルあたり0.1百万Hep G2細胞を座る。
標準RPMI 1640を1ミリリットル加えます。摂氏37度、炭酸ガス5%を24時間事前にインキュベートし、細胞の付着を可能にします。前培養後、標準RPMI 1640培地を廃棄する。
そして、ステアトゲン培地を追加します。上清を捨て、24時間ごとに新鮮なステア原性培地を追加します。生存率と形態評価を行うために、上清を捨て、0.05%トリプシンEDTAの500マイクロリットルを加えることによってウェルから細胞を取り外します。
摂氏37度と炭酸ガス5%で5分間インキュベートします。マイクロチューブに再懸濁細胞を収集します。そして遠心分離機を300倍G.で、その上清を捨て、200マイクロリットルの標準RPMI 1640を加え、細胞を再懸濁する。
新鮮なマイクロチューブに0.4%のトリパンブルー溶液の15マイクロリットルを加えます。前の細胞懸濁液の15マイクロリットルを加え、混合する。血球計で染色された細胞と非染色細胞を数え、生存率と死亡率を計算します。
24ウェルプレートに細胞培養カバースリップを入れ、テキスト原稿に記載されているようにHep G2細胞をシードします。適切なインキュベーションの後、PBSの1ミリリットルで細胞を洗浄し、上清を捨てます。PBSで4%パラホルムアルデヒドの1ミリリットルと混合し、室温で1時間インキュベートします。
余分なパラホルムアルデヒドを捨て、蒸留水を1ミリリットルで細胞をすすいでください。その後、70%イソプロパノールの1ミリリットルを加え、5分間インキュベートします。余分なイソプロパノールを捨て、オイルレッドO溶液を1ミリリットル加え、30分間インキュベートします。
余分な油赤O溶液を捨て、蒸留水1ミリリットルですすいます。顕微鏡下の細胞を400倍の倍率で観察します。ウェルの完全な領域から10個の光学フィールドの写真をランダムに選択してキャプチャします。
すべての井戸に対してイメージングを繰り返します。赤い染色領域の割合を評価するには、ImageJソフトウェアを開き、必要なファイルをインポートし、調整をクリックして、色のしきい値を使用して"ツールは、赤の色検出のための色合いパラメータを定義します。次に、画像の彩度と明るさを調整します。
「粒子を分析」ツールを使用して、光学フィールドの完全な面積と染色面積を比較し、すべてのウェルの平均割合を計算します。24ウェルプレートのウェルあたり0.1万人の肝細胞を座席に置き、最適な合流を提供します。生存率は、培養の時間が増加するにつれて徐々に減少し、重度の断層化の4日間で最低の60%に達した。
従って、ステア原性条件下で培養した肝細胞において死亡率が高かった。そして、それは脂質への暴露の時間とともに徐々に増加した。細胞数は増殖の結果として徐々に増加した。
しかし、3日と4日で軽度の脊椎間症では増殖率が低かった。対照的に、重度のステアトーシスは、24時間による増殖の低下と関連していた。オイルレッドOを用いた染色細胞は、脂肪原性条件下で培養された細胞における脂質滴の少なくとも2倍の増加を実証した。
細胞内脂肪は、脂肪原性培地における培養の暴露の時間に従って増加した。軽度の脂肪取りでは、脂質含量は2日目から増加し、重度の脂肪症では24時間から有意に高かった。細胞培養には以前の経験が必要です。
このプロトコルを使用する前に、標準的な条件でHep G2細胞を培養することが有用である可能性があります。脂肪酸ストックの調製も重要なポイントです。パルミチ酸は室温で固体であり、管理する前に温める必要があります。
この方法は、増殖、アポトーシス、オートファギア、酸化ストレス、薬理学的および毒性分析を含むが、これらに限定されない異なる経路の分子分析を可能にするべきである。
