Ce protocole est applicable à l’étude de la stéatose hépatique ainsi qu’aux voies hépatiques, métaboliques, synthétiques et de toxification dans le contexte de la stéatose. Les principaux avantages de cette méthode sont sa reproductibilité et le peu de temps nécessaire pour obtenir des résultats. Ajoutez à cela le fait qu’il offre deux niveaux de stéatose, légère et sévère.
La stéatose induite in vitro pourrait fournir des preuves pour l’identification de marqueurs potentiels pour le diagnostic de la maladie, ainsi que de cibles thérapeutiques. Cette méthode est destinée à être appliquée dans le résultat de la stéatose. Cependant, il peut être ajusté à un large éventail de cellules différentes affectées par des surexpositions aux lipides, comme lors de l’obésité et de la lipidémie.
Préparez le RPMI 1640 standard. Complétez le milieu de culture RPMI 1640 avec 10% de FBS activé par la chaleur et 1% de solution de streptomycine de pénicilline. Stérilisez-le à l’aide de filtres de 0,22 micromètre et stockez le supplément à quatre degrés Celsius.
Pour préparer une solution mère de palmitate, préparez une solution de palmitate de 50 millimolaires dans le RPMI 1640 standard complété par 1% de BSA sans lipides. Stériliser environ cinq à dix millilitres de la solution d’origine à l’aide de filtres de 0,22 micromètre et conserver à quatre degrés Celsius à l’abri de la lumière pendant un mois. Pour préparer la solution mère d’oléate, préparez une solution d’oléate de 50 millimolaires dans le RPMI 1640 supplémenté.
Et stérilisez la solution d’élevage à l’aide de filtres de 0,22 micromètre. Conservez-le à moins 20 degrés Celsius, à l’abri de la lumière jusqu’à un mois. Pour préparer le milieu stéatogène à partir des stocks préalablement préparés, préparez 100 millimètres d’un mélange de 50 micromolaires d’une partie de palmitate et de deux parties d’oléate.
Pour les niveaux doux, versez un mélange de 500 micromolaires d’une partie de palmitate et de deux parties d’oléate pour les niveaux sévères dans rpmI 1640 standard. Et stériliser à l’aide de filtres de 0,22 micromètre. Conserver à quatre degrés Celsius jusqu’à une semaine.
Alternativement, pour préparer des solutions d’origine avec les acides gras respectifs en utilisant de l’albumine lipidique libre, dissoudre le palmitate ou l’oléate dans deux millilitres d’éthanol absolu, puis mélanger dans le volume final du RPMI standard 1640. Dissoudre l’oléate directement en le stockant dans un milieu de culture RPMI 1640 standard. Permettre l’évaporation de l’éthanol en incubant dans un bain-marie à 70 degrés Celsius et bien mélanger.
Stérilisez les deux solutions d’élevage à l’aide de filtres de 0,22 micromètre et stockez la solution de palmitate à quatre degrés Celsius. Et solution d’oléate à moins 20 degrés Celsius. Placez 0,1 million de cellules Hep G2 par puits dans une plaque de 24 puits.
Ajoutez un millilitre de RPMI 1640 standard. Pré-incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 24 heures, permettant la fixation cellulaire. Après la préculture, jetez le support RPMI 1640 standard.
Et ajoutez le milieu stéatogène. Jeter le surnageant et ajouter un milieu stéatogène frais toutes les 24 heures. Pour effectuer une évaluation de la viabilité et de la morphologie, jetez le surnageant et détachez les cellules du puits en ajoutant 500 microlitres de 0,05% de trypsine EDTA.
Incuber pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Recueillir les cellules ressuspendées dans un microtube. Et centrifuger à 300 fois G.Ensuite, jetez le surnageant, ajoutez 200 microlitres de RPMI 1640 standard et ressuspendez les cellules.
Ajouter 15 microlitres de 0,4% de solution de bleu de trypan dans un microtube frais. Ajouter et mélanger 15 microlitres de la suspension cellulaire précédente. Compter les cellules colorées et non colorées dans un hémocytomètre et calculer les taux de viabilité et de mortalité.
Mettez un couvercle de culture cellulaire dans chaque puits d’une plaque de 24 puits et ensemencez des cellules Hep G2 comme décrit dans le manuscrit du texte. Après l’incubation appropriée, lavez les cellules avec un millilitre de PBS et jetez le surnageant. Mélangez-les avec un millilitre de 4% de paraformaldéhyde dans du PBS et incubez pendant une heure à température ambiante.
Jetez l’excès de paraformaldéhyde et rincez les cellules avec un millilitre d’eau distillée. Ajoutez ensuite un millilitre d’isopropanol à 70% et incubez pendant cinq minutes. Jeter l’excès d’isopropanol et ajouter un millilitre de solution Oil-Red O et incuber pendant 30 minutes.
Jetez l’excès de solution Oil-Red O, puis rincez avec un millilitre d’eau distillée. Observez les cellules au microscope à un grossissement de 400x. Sélectionnez et capturez au hasard des photographies de 10 champs optiques à partir de la zone complète du puits.
Répétez l’imagerie pour chaque puits. Pour évaluer le pourcentage de zone colorée rouge, ouvrez le logiciel ImageJ et importez les fichiers requis, puis cliquez sur ajuster et en utilisant l’outil « seuil de couleur », définissez le paramètre de teinte pour la détection de couleur rouge. Ajustez ensuite la saturation et la luminosité de l’image.
Comparez la zone colorée avec la zone complète du champ optique, à l’aide de l’outil d’analyse des particules et calculez le pourcentage moyen de chaque puits. Accueillir 0,1 million d’hépatocytes par puits dans des plaques de 24 puits offre une confluence optimale. La viabilité diminuait progressivement à mesure que le temps de culture augmentait, atteignant le plus bas de 60% à quatre jours dans la stéatose sévère.
En conséquence, le taux de mortalité était plus élevé dans les hépatocytes cultivés dans les conditions stéatogènes. Et il a progressivement augmenté avec le temps d’exposition aux lipides. Le nombre de cellules a progressivement augmenté en raison de la prolifération.
Cependant, le taux de prolifération était plus faible dans la stéatose légère à trois et quatre jours. En revanche, la stéatose sévère était associée à une prolifération plus faible de 24 heures. La coloration des cellules avec de l’O rouge huile a démontré au moins une multiplication par deux des gouttelettes lipidiques dans les cellules cultivées dans des conditions stéatogènes.
La graisse intracellulaire a augmenté en fonction du temps d’exposition de la culture dans le milieu stéatogène. Dans la stéatose légère, les teneurs en lipides ont augmenté à partir du deuxième jour, tandis que dans la stéatose sévère, elles étaient significativement élevées à partir de 24 heures. La culture cellulaire nécessite une expérience préalable.
Cultiver des cellules Hep G2 dans un état standard avant d’utiliser ce protocole pourrait être utile. La préparation du stock d’acides gras est également un point crucial. L’acide palmitique est solide à température ambiante et doit être réchauffé avant sa gestion.
Cette méthode devrait permettre l’analyse moléculaire de différentes voies, y compris, mais sans s’y limiter, la prolifération, l’apoptose, l’autophagie, le stress oxydatif et l’analyse pharmacologique et toxicologique.
