Dieses Protokoll ist anwendbar auf die Untersuchung der Lebersteatose sowie auf die leberischen, metabolischen, synthetischen und toxifizierungswege im Zusammenhang mit Steatose. Die Hauptvorteile dieser Methode sind ihre Reproduzierbarkeit und die kurze Zeit, die benötigt wird, um Ergebnisse zu erzielen. Fügen Sie hinzu, dass es zwei Ebenen der Steatose bietet, mild und schwer.
In-vitro-induzierte Steatose könnte Hinweise auf die Identifizierung potenzieller Marker für die Diagnose der Krankheit sowie therapeutischer Ziele liefern. Diese Methode soll im Steatoseergebnis angewendet werden. Es kann jedoch an eine Vielzahl verschiedener Zellen angepasst werden, die von Lipidüberbelichtungen betroffen sind, z. B. bei Fettleibigkeit und Lipidämie.
Bereiten Sie standard rpmI 1640 vor. Ergänzen Sie RPMI 1640 Kulturmedium mit 10% wärmeaktiviertem FBS und 1% Penicillin Streptomycinlösung. Sterilisieren Sie es mit 0,22-Mikrometer-Filtern und lagern Sie das Supplement bei vier Grad Celsius.
Zur Herstellung einer Palmitat-Stammlösung ist eine 50-Millimolar-Palmitatlösung im Standard RPMI 1640 mit 1% lipidfreiem BSA zuzubereiten. Mit 0,22-Mikrometer-Filtern etwa fünf bis zehn Milliliter der Stammlösung sterilisieren und bei vier Grad Celsius lichtgeschützt bis zu einem Monat lagern. Zur Herstellung der Oleat-Stammlösung wird eine 50-Millimolar-Oleatlösung im ergänzten RPMI 1640 vorbereitet.
Und sterilisieren Sie die Stammlösung mit 0,22-Mikrometer-Filtern. Lagern Sie es bei minus 20 Grad Celsius, geschützt vor Licht für bis zu einem Monat. Um steatogenes Medium aus den zuvor vorbereiteten Beständen herzustellen, bereiten Sie 100 Millimeter einer 50-mikromolaren Mischung aus einem Teil Palmitat und zwei Teilen Oleat vor.
Für milde Niveaus gießen Sie eine 500-Mikromolar-Mischung aus einem Teil Palmitat und zweiTeil Oleat für schwere Konzentrationen in Standard-RPMI 1640. Und sterilisieren Sie mit 0,22-Mikrometer-Filtern. Bis zu einer Woche bei vier Grad Celsius lagern.
Alternativ können Sie zur Herstellung von Stammlösungen mit den jeweiligen Fettsäuren unter Verwendung von freiem Lipidalbumin entweder Palmitat oder Oleat in zwei Millilitern absolutem Ethanol auflösen und dann das Endvolumen von Standard-RPMI 1640 mischen. Oleat direkt durch Lagerung in Standard-RPMI 1640-Kulturmedium auflösen. Ethanol durch Inkubation in einem Wasserbad bei 70 Grad Celsius verdampfen lassen und gründlich mischen.
Sterilisieren Sie beide Stammlösungen mit 0,22-Mikrometer-Filtern und lagern Sie die Palmitat-Stammlösung bei vier Grad Celsius. Und Oleat-Stammlösung bei minus 20 Grad Celsius. Platz 0,1 Millionen Hep G2 Zellen pro Vertiefung in einer 24-Well-Platte.
Fügen Sie einen Milliliter Standard-RPMI 1640 hinzu. Bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 24 Stunden vorinkubieren, um die Zellanhaftung zu ermöglichen. Verwerfen Sie nach der Vorkultur das Standardmedium RPMI 1640.
Und fügen Sie das steatogene Medium hinzu. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie alle 24 Stunden ein frisches steatogenes Medium hinzu. Um die Lebensfähigkeit und Morphologie zu bewerten, verwerfen Sie den Überstand und lösen Sie die Zellen aus dem Bohrplatz, indem Sie 500 Mikroliter von 0,05% Trypsin EDTA hinzufügen.
Fünf Minuten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid inkubieren. Sammeln Sie die resuspendierten Zellen in einem Mikroröhrchen. Und Zentrifuge bei 300-fach G.Dann verwerfen Sie den Überstand, fügen Sie 200 Mikroliter Standard-RPMI 1640 hinzu und resuspendieren Sie die Zellen.
Fügen Sie 15 Mikroliter von 0,4% Trypanblaulösung in eine frische Mikroröhre hinzu. Fügen Sie 15 Mikroliter der vorherigen Zellsuspension hinzu und mischen Sie sie. Zählen Sie die gefärbten und nicht gefärbten Zellen in einem Hämozytometer und berechnen Sie die Lebensfähigkeit und Mortalitätsraten.
Legen Sie in jede Vertiefung eine Zellkulturabdeckung in eine 24-Well-Platte und samen Sie Hep G2-Zellen, wie im Textmanuskript beschrieben. Nach der entsprechenden Inkubation die Zellen mit einem Milliliter PBS waschen und den Überstand entsorgen. Mischen Sie sie mit einem Milliliter 4% Paraformaldehyd in PBS und inkubieren Sie sie eine Stunde bei Raumtemperatur.
Entsorgen Sie das überschüssige Paraformaldehyd und spülen Sie die Zellen mit einem Milliliter destilliertem Wasser ab. Dann fügen Sie einen Milliliter 70% Isopropanol hinzu und inkubieren Sie für fünf Minuten. Entsorgen Sie das überschüssige Isopropanol und fügen Sie einen Milliliter Oil-Red O-Lösung hinzu und inkubieren Sie es für 30 Minuten.
Entsorgen Sie die überschüssige Oil-Red O-Lösung und spülen Sie sie dann mit einem Milliliter destilliertem Wasser ab. Beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop bei einer Vergrößerung von 400x. Wählen Sie zufällig Fotos von 10 optischen Feldern aus dem gesamten Bereich des Brunnens aus und nehmen Sie sie auf.
Wiederholen Sie die Bildgebung für jeden Brunnen. Um den Prozentsatz des rot gefärbten Bereichs zu beurteilen, öffnen Sie die ImageJ-Software und importieren Sie die erforderlichen Dateien, klicken Sie dann auf Anpassen und definieren Sie mit dem Werkzeug "Farbschwellenwert" den Farbtonparameter für die Rote-Farberkennung. Passen Sie dann die Sättigung und Helligkeit für das Bild an.
Vergleichen Sie den gefärbten Bereich mit dem gesamten Bereich des optischen Feldes, indem Sie das Werkzeug "Partikel analysieren" verwenden und den durchschnittlichen Prozentsatz jeder Vertiefung berechnen. Der Sitz von 0,1 Millionen Hepatozyten pro Vertiefung in 24-Well-Platten sorgt für eine optimale Konfluenz. Die Lebensfähigkeit nahm mit zunehmender Zeit der Kultur allmählich ab und erreichte nach vier Tagen bei schwerer Steatose den niedrigsten Wert von 60%.
Dementsprechend war die Sterblichkeitsrate in Hepatozyten, die unter den steatogenen Bedingungen kultiviert wurden, höher. Und es nahm mit der Zeit der Exposition gegenüber Lipiden allmählich zu. Die Zellzahlen nahmen infolge der Proliferation allmählich zu.
Die Proliferationsrate war jedoch bei leichter Steatose nach drei und vier Tagen niedriger. Im Gegensatz dazu war eine schwere Steatose mit einer geringeren Proliferation um 24 Stunden verbunden. Die Färbung von Zellen mit Oil-Red O zeigte eine mindestens zweifache Zunahme von Lipidtröpfchen in Zellen, die unter steatogenen Bedingungen kultiviert wurden.
Intrazelluläres Fett erhöhte sich entsprechend dem Zeitpunkt der Exposition der Kultur im steatogenen Medium. Bei leichter Steatose waren die Lipidgehalte ab dem zweiten Tag erhöht, während sie bei schwerer Steatose ab 24 Stunden signifikant hoch waren. Zellkultur erfordert Vorerfahrung.
Die Kultivierung von Hep G2-Zellen in einem Standardzustand vor der Verwendung dieses Protokolls könnte hilfreich sein. Auch die Zubereitung des Fettsäurevorrats ist ein entscheidender Punkt. Palmitinsäure ist bei Raumtemperatur fest und muss vor ihrer Behandlung erwärmt werden.
Diese Methode sollte die molekulare Analyse verschiedener Signalwege ermöglichen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Proliferation, Apoptose, Autophagie, oxidativen Stress und pharmakologische und toxikologische Analysen.
