Questo protocollo è applicabile allo studio della steatosi epatica e alle vie epatiche, metaboliche, sintetiche e di tossificazione nel contesto della steatosi. I principali vantaggi di questo metodo sono la sua riproducibilità e il breve tempo necessario per ottenere risultati. Aggiungi il fatto che offre due livelli di steatosi, lieve e grave.
La steatosi indotta in vitro potrebbe fornire prove per l'identificazione di potenziali marcatori per la diagnosi della malattia, nonché di bersagli terapeutici. Questo metodo è destinato ad essere applicato nel risultato della steatosi. Tuttavia, può essere adattato a una vasta gamma di cellule diverse colpite da sovra-esposizioni lipidiche, come durante l'obesità e la lipidemia.
Preparare lo standard RPMI 1640. Integrare il terreno di coltura RPMI 1640 con il 10% di FBS attivato dal calore e l'1% di soluzione di streptomicina di penicillina. Sterilizzarlo utilizzando filtri da 0,22 micrometri e conservare il supplemento a quattro gradi Celsius.
Per preparare una soluzione stock di palmitato preparare una soluzione da 50 millimolari di palmitato nello standard RPMI 1640 integrato con l'1% di BSA senza lipidi. Sterilizzare da cinque a dieci millilitri della soluzione stock utilizzando filtri da 0,22 micrometri e conservare a quattro gradi Celsius al riparo dalla luce per un massimo di un mese. Per preparare la soluzione di brodo oleato preparare una soluzione di oleato da 50 millimolari nel RPMI 1640 integrato.
E sterilizzare la soluzione stock utilizzando filtri da 0,22 micrometri. Conservalo a meno 20 gradi Celsius, al riparo dalla luce per un massimo di un mese. Per preparare il mezzo steatogeno dalle scorte precedentemente preparate, preparare 100 millimetri di una miscela di 50 micromolari di una parte di palmitato e due parti di oleato.
Per livelli lievi, versare una miscela di 500 micromolari di una parte di palmitato e due parti di oleato per livelli severi in RPMI 1640 standard. E sterilizzare utilizzando filtri da 0,22 micrometri. Conservare a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana.
In alternativa, per preparare soluzioni madre con i rispettivi acidi grassi utilizzando albumina lipidica libera, sciogliere palmitato o oleato in due millilitri di etanolo assoluto e quindi mescolare nel volume finale dello standard RPMI 1640. Sciogliere l'oleato direttamente conservandolo nel terreno di coltura standard RPMI 1640. Consentire l'evaporazione dell'etanolo incubando a bagnomaria a 70 gradi Celsius e mescolare accuratamente.
Sterilizzare entrambe le soluzioni stock utilizzando filtri da 0,22 micrometri e conservare la soluzione stock di palmitato a quattro gradi Celsius. E soluzione stock di oleato a meno 20 gradi Celsius. Sedile 0,1 milioni di celle Hep G2 per pozzetti in una piastra a 24 pozzetti.
Aggiungere un millilitro di RPMI 1640 standard. Pre-incubazione a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 24 ore, consentendo l'attaccamento cellulare. Dopo la precoltura, scartare il supporto RPMI 1640 standard.
E aggiungi il mezzo steatogeno. Scartare il surnatante e aggiungere un mezzo steatogeno fresco ogni 24 ore. Per eseguire la valutazione della vitalità e della morfologia, scartare il surnatante e staccare le cellule dal pozzo aggiungendo 500 microlitri di 0,05% di tripsina EDTA.
Incubare per cinque minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Raccogliere le cellule riconsependite in un micro tubo. E centrifugare a 300 volte G.Quindi scartare il surnatante, aggiungere 200 microlitri di RPMI 1640 standard e sostituire le celle.
Aggiungere 15 microlitri dello 0,4% di soluzione blu di tripano in un microtubo fresco. Aggiungere e mescolare 15 microlitri della sospensione cellulare precedente. Contare le cellule colorate e non macchiate in un emocitometro e calcolare i tassi di vitalità e mortalità.
Metti una copertura di coltura cellulare in ogni pozzo in una piastra a 24 pozzetti e semina cellule Hep G2 come descritto nel manoscritto di testo. Dopo l'appropriata incubazione, lavare le cellule con un millilitro di PBS e scartare il surnatante. Mescolarli con un millilitro di paraformaldeide al 4% in PBS e incubare per un'ora a temperatura ambiente.
Scartare l'eccesso di paraformaldeide e risciacquare le cellule con un millilitro di acqua distillata. Quindi aggiungere un millilitro di isopropanolo al 70% e incubare per cinque minuti. Scartare l'isopropanolo in eccesso e aggiungere un millilitro di soluzione di Oil-Red O e incubare per 30 minuti.
Scartare la soluzione oil-red O in eccesso e quindi risciacquare con un millilitro di acqua distillata. Osservare le cellule al microscopio con un ingrandimento di 400x. Seleziona e cattura in modo casuale fotografie di 10 campi ottici dall'area completa del pozzo.
Ripeti l'imaging per ogni pozzo. Per valutare la percentuale di area macchiata di rosso, aprire il software ImageJ e importare i file richiesti, quindi fare clic su Regola e utilizzando lo strumento soglia colore, definire il parametro tonalità per il rilevamento del colore rosso. Quindi regolare la saturazione e la luminosità per l'immagine.
Confronta l'area macchiata con l'area completa del campo ottico, utilizzando lo strumento analizza particelle e calcola la percentuale media di ogni pozzo. 0,1 milioni di epatociti per pozzo in piastre a 24 pozzi forniscono una confluenza ottimale. La vitalità è progressivamente diminuita con l'aumentare del tempo della coltura, raggiungendo il minimo del 60% a quattro giorni nella steatosi grave.
Di conseguenza, il tasso di mortalità era più alto negli epatociti coltivati in condizioni steatogene. E aumentava progressivamente con il tempo di esposizione ai lipidi. Il numero di cellule è aumentato progressivamente a causa della proliferazione.
Tuttavia, il tasso di proliferazione era più basso nella steatosi lieve a tre e quattro giorni. Al contrario, la steatosi grave è stata associata a una minore proliferazione di 24 ore. La colorazione delle cellule con Oil-Red O ha dimostrato un aumento di almeno due volte delle goccioline lipidiche nelle cellule coltivate in condizioni steatogene.
Il grasso intracellulare è aumentato in base al tempo di esposizione della coltura nel mezzo steatogeno. Nella steatosi lieve, il contenuto lipidico è aumentato dal secondo giorno, mentre nella steatosi grave è stato significativamente elevato a partire dalle 24 ore. La coltura cellulare richiede un'esperienza precedente.
Coltivare cellule Hep G2 in una condizione standard prima di utilizzare questo protocollo potrebbe essere utile. Anche la preparazione dello stock di acidi grassi è un punto cruciale. L'acido palmitico è solido a temperatura ambiente e deve essere riscaldato prima della sua gestione.
Questo metodo dovrebbe consentire l'analisi molecolare di diverse vie, tra cui, ma non solo, proliferazione, apoptosi, autofagia, stress ossidativo e analisi farmacologiche e tossicologiche.
