يصف هذا البروتوكول كيفية الحث على ترسب الكبد في خلايا الكبد المختلفة وطرق الكشف عن تراكم الدهون وتحديد كمه. يمثل هذا النموذج خلية الإنسان في المختبر بديلا قيما لنماذج الفئران في الجسم الحي و الكبدات البشرية الأولية. ذوبان النيتروجين cryopreserved دفعة منخفضة الممر من خلايا HepaRG عن طريق غمرها في حمام 37 درجة مئوية حتى تذاب.
نقل الخلايا بسرعة إلى أنبوب 15 ملليلتر تحتوي على 10 ملليلتر من المتوسط المتكاثر. بعد الطرد المركزي لمدة خمس دقائق ، والتخلص من السوبر وrsuspend الخلايا في خمسة ملليلتر من المتوسط المتكاثر. عد الخلايا وتمييع من أجل لوحة 250، 000 خلية لكل سنتيمتر مربع.
لوحة الخلايا على 100 ملليمتر أطباق ثقافة الخلية وتجديد المتوسطة كل يومين أو ثلاثة أيام. تتكاثر الخلايا مع تضاعف الوقت حوالي 24 ساعة. مرة واحدة في خلايا HepaRG تصل إلى 80٪ التقاء، وفصل لهم من خلال حضانة لمدة ثلاث إلى خمس دقائق مع 0.05٪ تريبسين الحل.
جمع الخلايا في المتوسط المتكاثر والطرد المركزي لمدة خمس دقائق كما كان من قبل. تجاهل افراط وإعادة تعليق الخلايا مع خمسة ملليلتر من المتوسط المتكاثر. مرة أخرى، عد الخلايا وتمييع من أجل لوحة 250، 000 خلية لكل سنتيمتر مربع.
في هذه المرحلة، تضخيم الخلايا بتكرار هذه الخطوات للوصول إلى عدد مناسب من الخلايا لبدء التجارب. للتبريد خلايا HepaRG، قم بفصل الخلايا بعد 24 ساعة من الطلاء من خلال حضانة لمدة ثلاث إلى خمس دقائق مع محلول 0.05٪trypsin. جمع الخلايا في المتوسط المتكاثر والطرد المركزي لمدة خمس دقائق كما كان من قبل.
تجاهل supernatant، resuspend الخلايا في ملليلتر واحد لكل دفعة من متوسط التجميد، ولتبريد دفعات في النيتروجين السائل. في اليوم صفر، بذور خلايا HepaRG في 250،000 الخلايا في سنتيمتر مربع في الأطباق المعالجة بالثقافة مع حجم مناسب من متوسط الانتشار. هناك طبقان يجب أن يكون مطليا لكل مقايسة، أحدهما لخلايا التحكم و الآخر للخلايا المعالجة بالوليات.
في اليوم الثاني واليوم الرابع، قم بتغيير الوسط مع حجم مناسب من وسيط الانتشار ودع الخلايا تنمو حتى تصل إلى التقاء. في اليوم السابع، يجب أن تكون الخلايا 100٪. غسل الخلايا مرة واحدة مع 1X PBS.
ثم، إزالة 1X PBS وإضافة حجم مناسب من التمايز المتوسطة. في الأيام ثمانية وتسعة و12 و15 و18، تغسل الخلايا مرة واحدة مع 1X PBS قبل إضافة حجم مناسب من المتوسط التمايز. في اليوم 21، لاحظ خلايا HepaRG تحت المجهر وتأكد من أن الخلايا هي ثقافات متباينة التقاء.
كتحكم، حصاد طبق تحكم واحد لإجراء تحليل التعبير الجيني للجينات علامة التمايز. في اليوم 21، يمكن أن تكون خلايا هيبارج المتمايزة في النيتروجين السائل. في اليوم 21، تخفيف الأوليات الصوديوم مع حجم مناسب من التمايز الكامل المتوسطة إلى التركيز النهائي من 250 ميكرومولار.
إضافة 99٪ الميثانول بنسبة واحد إلى 400 في aliquot آخر من التمايز المتوسطة لجعل معالجة التحكم في السيارة. غسل الخلايا مرة واحدة مع 1X PBS وإضافة السيارة أو الصوديوم oleate المتوسطة. في اليوم 23 واليوم 25، قم بتغيير الوسط مع الحجم المناسب من المتوسط الطازج.
في اليوم 26 ، لاحظ الخلايا عن طريق المجهر البصري. قطرات الدهون تتراكم في الخلايا المعالجة oleate الصوديوم و يمكن رؤيتها بسهولة مثل قطرات شفافة في السيتوبلازم. لأداء النفط الأحمر O تلطيخ، أولا غسل الخلايا مرة واحدة مع 1X PBS وإزالة برنامج تلفزيوني 1X تماما.
أضف 4٪ شبه شكلي واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة شبهformaldehyde وغسل الخلايا مرتين مع 1X PBS. بعد إزالة برنامج تلفزيوني، احتضان الخلايا مع 60٪ isopropanol لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
إزالة ايزوبروبانول والسماح للخلايا الجافة تماما في درجة حرارة الغرفة. الآن إضافة زيت الأحمر O حل العمل إلى الخلايا واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. حجم حل العمل المطلوبة لكل عينة يتوافق مع حجم الوسائط المستخدمة لمعالجة الخلايا.
قم بإزالة محلول Oil Red O وأضيف الماء المقطر المزدوج على الفور. بعد غسل الخلايا أربع مرات مع الماء المقطر المزدوج، الحصول على الصور تحت المجهر للتحليل. ل elute صبغة O النفط الأحمر، وإزالة كل الماء والسماح لتجف.
ثم، إضافة ملليلتر واحد من 100٪ isopropanol واحتضان لمدة 10 دقائق مع اهتزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة. الميبت ايزوبروبانول مع زيت مائل O صبغة صعودا وهبوطا عدة مرات، وضمان أن جميع O النفط الأحمر هو في الحل. نقل الحل إلى cuvette.
قياس الكثافة البصرية في 500 نانومتر بواسطة القياس الطيفي واستخدام 100٪ isopropanol كما فارغة. غسل الخلايا مرة واحدة مع 1X PBS. ثم، احتضان مع 100 نانومولار من بوديبي المخفف في 1X PBS في الظلام لمدة 40 دقيقة في 37 درجة مئوية.
يجب تضمين عنصر تحكم غير ملوث في قياسات قياس قياس التدفق. إزالة حل تلطيخ وغسل الخلايا مرة واحدة مع 1X PBS. ثم، وغسل الخلايا مرة أخرى وإزالة برنامج تلفزيوني تماما.
أضف 4٪ شبه شكلي واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة شبهformaldehyde وغسل العينات ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في برنامج تلفزيوني. يمكن الاحتفاظ بالخلايا في PBS 1X عند أربع درجات مئوية أو تصويرها على الفور.
للتخزين، والتفاف مع بارا فيلم وتغطية مع رقائق الألومنيوم لمنع الخلايا من التجفيف. للتحقق من كفاءة الحث على ستاتيس، كانت ملطخة oleate-المعالجة والتحكم خلايا HepaRG مع زيت الأحمر O صبغة. بعد تلطيخ، قطرات الدهون مرئية بسهولة كما قطرات حمراء.
يمكن قياس تلطيخ بواسطة قياس الطيفي لصبغة الزيت R O مع الايزوبروبانول. امتصاص زيت أحمر O مائل من الخلايا يتناسب بشكل مباشر مع تراكم قطرات الدهون السيتوبلازمية. تم تحديد تركيز الأوليات الصوديوم ووقت التعرض من قبل MTT قياس الخلية قياسي قياسي.
يتم تحديد كمية المنتج Formosan من خلال امتصاصه في 490 نانومتر وتناسباً مباشراً مع عدد الخلايا الحية في الثقافة. تمت مقارنة علاج أوليات الصوديوم لعلاج بالميتات الصوديوم. تم استخدام دوكسوروبيسين المخدرات المبرمجة كتحكم.
لقياس الزيادة في محتوى الدهون الخلوية بعد علاج الأوليات الصوديوم، تم استخدام تلطيخ مع صبغة بوديبي لتسمية قطرات الدهون. باستخدام تحليل cytofluorometric ، فمن الممكن تحديد محتوى الدهون الثلاثية بواسطة بوديبي يعني كثافة الفلورسنت ، وهو أعلى في الخلايا المعالجة الأوليات بالمقارنة مع الخلايا التحكم. وهذا يشير إلى تراكم الدهون كفاءة بعد المعالجة oleate.
في الواقع، تظهر صور الخلايا الملطخة بصدبي قطرات الدهون الفلورية الخضراء الساطعة في الخلايا المعالجة بال oleate التي لا تظهر في خلايا التحكم. لمزيد من وصف تراكم قطرات الدهون بعد معالجة الأوليات الصوديوم، يمكن إجراء المجهر CARS كما هو موضح في بروتوكول النص الذي يتيح تكميم قطرات الدهون دون وضع العلامات. هذا النموذج القائم على الخلايا قد يزيد من المعرفة بالآليات الجزيئية المشاركة في أمراض الكبد الدهنية غير المُتَزَهَنة ويمكن أن يؤدي إلى وضع علامات جديدة للتشخيص المبكر واستراتيجيات العلاج الجديدة.
