يسمح هذا البروتوكول في السيلولو بتحديد كمية الحمض النووي واستئصال الحمض النووي بعد تلف الحمض النووي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي وضع علامة على دورة الخلية التي تقيد الخلايا إلى المرحلة S و G2 ، مما يضمن نتائج إشارة بروموديوكسي يوريدين من الحمض النووي والاستئصال. وسيشارك في هذا الإجراء جان إيف ماسون، الباحث الرئيسي، وسفيان المرساوي، باحث ما بعد الدكتوراه.
من خلال العمل تحت غطاء استزراع معقم ، ضع غطاء واحدا في كل بئر من صفيحة من ستة آبار لأكبر عدد ممكن من الظروف اللازمة. لوحة ما يقرب من 150،000 خلايا HeLa لنقل أو العلاج من تعاطي المخدرات. في اليوم الثالث ، بعد الحضانة بين عشية وضحاها مع BrdU بتركيز نهائي من 10 ميكرومولار ، قم بتشعيع الألواح بجرعة إجمالية قدرها خمسة رمادية من تشعيع الأشعة السينية.
بعد التشعيع ، أعد الألواح للحضانة عند 37 درجة مئوية في حاضنة مبللة بأكسيد الكربون بنسبة 5٪ لمدة ثلاث ساعات. قبل الاستخراج ، قم بشفط الوسط واغسل الخلايا بعناية مرتين باستخدام PBS. بعد إزالة PBS ، أضف ملليلترين من المخزن المؤقت A قبل الاستخراج واحتضن الخلايا عند أربع درجات مئوية على الجليد لمدة 10 دقائق.
بعد 10 دقائق ، قم بشفط المخزن المؤقت A ، وأضف ملليلتر من المخزن المؤقت لتجريد الهيكل الخلوي B ، وكرر الحضانة. ثم قم بشفط المخزن المؤقت B بعناية واغسل الخلايا باستخدام PBS. بعد شفط PBS ، قم بإصلاح الخلايا عن طريق إضافة ملليلترين من 4٪ من بارافورمالدهيد تحت الغطاء الكيميائي.
بعد إزالة البارفورمالديهايد ويغسل باستخدام PBS ، قم بتغطية الأغطية بالميثانول البارد بنسبة 100٪ للحضانة عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة خمس دقائق واغسل الأغطية مرتين باستخدام PBS. من أجل التخلل ، احتضن الخلايا بملليلترين من PBS تحتوي على 0.5٪ Tritan X-100 في درجة حرارة الغرفة. بعد 15 دقيقة ، اغسل الغطاء ثلاث مرات بملليلتر من PBS.
للتلطيخ المناعي ، أضف ملليلترين من المخزن المؤقت المانع إلى كل بئر. بعد ساعة واحدة من الحضانة ، أضف 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأساسي إلى كل غطاء. استخدم الملقط لتغطية الأغطية ببارافيلم مربع ووضع البارافيلم بعناية لعدم إنشاء فقاعات.
ثم قم بتغطية الصفيحة بورق الألومنيوم واحتضن الجسم المضاد الأساسي بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية في غرفة رطبة. في اليوم التالي ، قم بإزالة مربعات parafilm واغسل الأغطية ثلاث مرات بملليلتر من PBS. بعد الغسيل ، أضف 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوي على كل غطاء وقم بتغطية الأغطية بمربع من البارافيلم كما هو موضح.
احتضن الجسم المضاد الثانوي في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة واحم اللوحة من الضوء باستخدام رقائق معدنية. ثم اغسل الأغطية ثلاث مرات بملليلتر من 1X PBS. للتلطيخ النووي ، أضف ملليلترين من محلول DAPI إلى كل غطاء واغسل الأغطية باستخدام PBS.
أضف 10 إلى 20 ميكرولتر من وسط التركيب الخاص ب IF على شرائح المجهر. استخدم الإبرة أو الملقط الناعم لرفع الغطاء من أسفل البئر. قم بمسح السائل الزائد بعناية عن طريق النقر على حافة واحدة بلطف على منشفة ورقية وقم بتركيب الغطاء على شرائح المجهر.
للحصول على الصور وتحليلها ، قم باستيراد هذه الملفات إلى CellProfiler وتحليلها باستخدام خط أنابيب عد البقع . تحديد الكائن الأساسي لتحديد البؤر باستخدام الإعدادات الموضحة في مخطوطة النص وقياس الكثافة. تظهر هنا صور تمثيلية لبؤر 5-bromo-2-prime-deoxyuridine وتكاثر مستضد الخلية النووي بعد التشعيع.
تم تصور مسارات الحمض النووي التي تم إنشاؤها على أنها بؤر متميزة. ثم تم تحديد البؤر المحددة كميا والتعبير عنها على أنها الكثافة المتكاملة الكلية لتلطيخ بروموديوكسي يوريدين في النوى. أظهر التلطيخ المشترك تمايزا بين الاستئصال قصير المدى بسبب الانضمام النهائي غير المتجانس والاستئصال بعيد المدى لإعادة التركيب المتماثل باستخدام جسم مضاد مضاد ل PCNA لتحديد الخلايا التي تمر بمرحلة S.
PCNA بارز في النواة ويصل إلى أقصى تعبير خلال المرحلة S من دورة الخلية مع تلطيخ مكثف للغاية. ثم يتم رسم النتيجة في القيم كمخطط مبعثر للتمييز بين النوى الإيجابية PCNA و PCNA السلبية. تتم إزالة النتائج السلبية PCNA من مجموعة البيانات للسماح بالتحليل القائم على كثافة BrdU بسبب إشارة BrdU المنخفضة بغض النظر عن الحالة.
تحتوي النوى السالبة PCNA على كثافة متكاملة قاعدية لبؤر BrdU تبلغ 900 وحدة تعسفية وتصل هذه القيمة إلى 1،800 وحدة فلكية في النوى الإيجابية PCNA. في حالة التحكم في siRNA ، تبلغ الكثافة المتكاملة لبؤر BrdU لكل نواة حوالي 1،500 وحدة فلكية في النوى الإيجابية PCNA. بعد ضربة قاضية فعالة من PARP-1 باستخدام siRNA ، لوحظت زيادة كبيرة في كثافة بؤر BrdU إلى ما يقرب من 1،900 وحدة فلكية.
يمكن أن توفر هذه التقنية رؤى رئيسية في المرحلة الأولى من إعادة التركيب المتماثل ، مما يساعد على تحديد ما إذا كان البروتين متورطا في الخطوة الأولى من مسار الإصلاح. يجب الحفاظ على وقت الحضانة للمخازن المؤقتة قبل الاستخراج بدقة. سيؤدي التعرض المفرط لهذه المخازن المؤقتة إلى انفصال الخلايا بشكل مفرط وزيادة إشارة الخلفية.
