Este protocolo permite la cuantificación del ADN y la resección del ADN después del daño del ADN. La principal ventaja de esta técnica es el marcado del ciclo celular que restringe las células a las fases S y G2, asegurando que la señal de bromodeoxiuridina resulte del ADN y la resección. La demostración del procedimiento estará a cargo de Jean-Yves Masson, investigador principal, y Sofiane Y.Mersaoui, investigador postdoctoral.
Trabajando bajo una campana de cultivo estéril, coloque una sola cubierta en cada pozo de una placa de seis pocillos para tantas condiciones como sea necesario. Placa de aproximadamente 150, 000 células HeLa para transfección o tratamiento farmacológico. En el tercer día, después de la incubación nocturna con BrdU a una concentración final de 10 micromolares, irradie las placas con una dosis total de cinco grises de irradiación de rayos X.
Después de la irradiación, devuelva las placas para la incubación a 37 grados Celsius en una incubadora humidificada con óxido de carbono al 5% durante tres horas. Para la preextracción, aspire el medio y lave cuidadosamente las células dos veces con PBS. Después de eliminar el PBS, agregue dos mililitros de tampón A previo a la extracción e incube las células a cuatro grados Celsius en hielo durante 10 minutos.
Después de 10 minutos, aspire el tampón A, agregue dos mililitros de tampón B de extracción de citoesqueleto y repita la incubación. Luego aspire cuidadosamente el tampón B y lave las células con PBS. Después de aspirar PBS, fije las células agregando dos mililitros de 4% de paraformaldehído debajo de la capucha química.
Después de la eliminación del paraformaldehído y los lavados con PBS, cubra los cubrecolchas con metanol 100% frío para la incubación a menos 20 grados centígrados durante cinco minutos y lave los cubrehojas dos veces con PBS. Para la permeabilización, incubar las células con dos mililitros de PBS que contengan 0,5% tritan X-100 a temperatura ambiente. Después de 15 minutos, lave las fundas tres veces con dos mililitros de PBS.
Para la inmunotinción, agregue dos mililitros de tampón de bloqueo a cada pozo. Después de una hora de incubación, agregue 100 microlitros de solución de anticuerpos primarios a cada cubierta. Use pinzas para cubrir las cubiertas con parafilm cuadrado y coloque cuidadosamente la parafilm para no crear burbujas.
Luego cubra la placa con papel de aluminio e incube el anticuerpo primario durante la noche a cuatro grados centígrados en una cámara humidificada. Al día siguiente, retire los cuadrados de la parapelícula y lave las fundas tres veces con dos mililitros de PBS. Después del lavado, agregue 100 microlitros de solución de anticuerpos secundarios en cada funda y cubra las cubiertas con un cuadrado de parapelícula como se ha demostrado.
Incubar el anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante una hora y proteger la placa de la luz con papel de aluminio. Luego lave los cubrehojas tres veces con dos mililitros de 1X PBS. Para la tinción nuclear, agregue dos mililitros de solución DAPI a cada funda y lave las cubiertas con PBS.
Agregue de 10 a 20 microlitros de medio de montaje específico de IF en los portaobjetos del microscopio. Use la aguja o pinzas finas para levantar el deslizamiento de la cubierta desde el fondo del pozo. Elimine con cuidado el exceso de líquido golpeando suavemente un borde sobre una toalla de papel y monte las fundas en los portaobjetos del microscopio.
Para la adquisición y el análisis de imágenes, importe estos archivos en CellProfiler y analícelos mediante la canalización de conteo de manchas. Identifique el objeto primario para identificar los focos utilizando la configuración descrita en el manuscrito de texto y mida la intensidad. Aquí se muestran imágenes representativas de la formación de focos de 5-bromo-2-prime-desoxiuridina y la proliferación de la tinción de antígenos nucleares celulares después de la irradiación.
Las huellas de ADN monocatenario generadas se visualizaron como focos distintos. Los focos identificados se cuantificaron y expresaron como la intensidad total integrada de la tinción de bromodeoxiuridina en los núcleos. La tinción conjunta mostró diferenciación entre la resección de corto alcance debido a la unión final no homóloga y la resección de largo alcance de la recombinación homóloga utilizando un anticuerpo anti-PCNA para identificar las células que pasan por la fase S.
El PCNA es prominente en el núcleo y alcanza la máxima expresión durante la fase S del ciclo celular con una tinción bastante intensa. El resultado en valores se traza como un diagrama de dispersión para discriminar entre núcleos PCNA positivos y PCNA negativos. Los resultados negativos de PCNA se eliminan del conjunto de datos para permitir el análisis basado en la intensidad de BrdU debido a la baja señal de BrdU independientemente de la condición.
Los núcleos negativos de PCNA albergan una intensidad basal integrada de focos de BrdU de 900 unidades arbitrarias y este valor alcanza 1.800 UA en núcleos positivos de PCNA. En la condición de control de siRNA, la intensidad integrada de los focos de BrdU por núcleo es de aproximadamente 1.500 UA en los núcleos PCNA positivos. Después de un derribo eficiente de PARP-1 utilizando un siRNA, se observó un aumento significativo en la intensidad de los focos de BrdU a aproximadamente 1, 900 UA.
Esta técnica puede proporcionar información clave sobre la primera etapa de la recombinación homóloga, ayudando así a identificar si una proteína está involucrada en el primer paso de la vía de reparación. El tiempo de incubación de los tampones previos a la extracción debe mantenerse estrictamente. La sobreexposición a estos búferes dará como resultado un desprendimiento celular excesivo y un aumento de la señal de fondo.
