פרוטוקול זה מאפשר כימות צלולו של DNA ו כריתה בעקבות נזק DNA. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא סימון מחזור התא המגביל את התאים לשלב S ו- G2, ומבטיח את תוצאות אות bromodeoxyuridine מ- DNA ו לכריתה. מי שידגימו את ההליך יהיו ז'אן-איב מאסון, חוקר ראשי, וסופיאן י.מרסאווי, חוקרת פוסט-דוקטורט.
בעבודה תחת מכסה מנוע תרבות סטרילי, מניחים כיסוי יחיד בכל באר של צלחת שש באר עבור התנאים הרבים הדרושים. צלחת כ 150, 000 תאי HeLa עבור transfection או טיפול תרופתי. ביום השלישי, לאחר הדגירה הלילית עם BrdU בריכוז סופי של 10 מיקרומולר, להקרין את הצלחות עם מנה כוללת של חמישה אפורים של הקרנת רנטגן.
לאחר ההקרנה, להחזיר את הצלחות לדגירה ב 37 מעלות צלזיוס בחממה לחה 5% תחמוצת פחמן במשך שלוש שעות. עבור טרום החילוץ, לשאוף את המדיום בזהירות לשטוף את התאים פעמיים עם PBS. לאחר הסרת PBS, מוסיפים שני מיליליטרים של מאגר טרום מיצוי A ודגור על התאים בארבע מעלות צלזיוס על קרח במשך 10 דקות.
לאחר 10 דקות, שאפו את המאגר A, הוסיפו שני מיליליטרים של חיץ הפשטת ציטוסקלטון B, וחזרו על הדגירה. ואז בזהירות לשאוף חיץ B ולשטוף את התאים עם PBS. לאחר שאיפה PBS, לתקן את התאים על ידי הוספת שני מיליליטר של 4% של paraformaldehyde מתחת למכסה המנוע הכימי.
לאחר הסרת paraformaldehyde ושוטף עם PBS, לכסות את כיסוי עם 100% מתנול קר עבור דגירה במינוס 20 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות לשטוף את כיסוי פעמיים עם PBS. עבור חדירות, דגירה התאים עם שני מיליליטרים של PBS המכיל 0.5% טריטן X-100 בטמפרטורת החדר. לאחר 15 דקות, לשטוף את כיסוי שלוש פעמים עם שני מיליליטרים של PBS.
עבור חיסון, להוסיף שני מיליליטרים של חוצץ חסימה לכל באר. לאחר שעה אחת של דגירה, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של תמיסת נוגדנים ראשונית לכל כיסוי. השתמש פינצטה כדי לכסות את כיסוי עם parafilm מרובע בזהירות למקם את parafilm כדי לא ליצור בועות.
לאחר מכן לכסות את הצלחת בנייר אלומיניום ולדגור את הנוגדן העיקרי לילה בארבע מעלות צלזיוס בתא לח. ביום שלמחרת, להסיר את ריבועי parafilm ולשטוף את כיסוי שלוש פעמים עם שני מיליליטר של PBS. לאחר הכביסה, מוסיפים 100 מיקרוליטרים של תמיסת נוגדנים משנית על כל כיסוי לכסות ולכסות את כיסויים עם ריבוע של parafilm כפי שהוכח.
לדגור על הנוגדן המשני בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת ולהגן על הצלחת מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום. ואז לשטוף את כיסוי שלוש פעמים עם שני מיליליטר של 1X PBS. להכתמה גרעינית, הוסיפו שני מיליליטר של תמיסת DAPI לכל כיסוי ושטפו את כיסויי הכיסוי עם PBS.
הוסף 10 עד 20 מיקרוליטרים של מדיום הרכבה ספציפי ל- IF בשקופיות מיקרוסקופ. השתמש במחט או פינצטה עדינה כדי להרים את כיסוי החלק התחתון של הבאר. יש להכתים בזהירות נוזלים עודפים על-ידי הקשה על קצה אחד בעדינות על מגבת נייר ולהרכיב את כיסויי הכיסוי על שקופיות מיקרוסקופ.
לרכישה וניתוח של תמונות, יבא קבצים אלה לתוך CellProfiler וניתח אותם באמצעות צינור ספירת כתמים. זהה את האובייקט הראשי כדי לזהות את המוקדים באמצעות ההגדרות המתוארות בכתב היד של הטקסט ומדוד את העוצמה. תמונות מייצגות של 5-bromo-2-prime-deoxyuridine מיקוד היווצרות והתפשטות תאים גרעיניים אנטיגן כתמים לאחר הקרנה מוצגים כאן.
עקבות הדנ"א החד-גדיליות שנוצרו נתפסו כמוקדי זיהוי ברורים. המוקדים המזוהים היו אז כימות ובא לידי ביטוי כמו העוצמה המשולבת הכוללת של כתמי bromodeoxyuridine בגרעינים. כתמים משותפים הראו הבחנה בין כריתה לטווח קצר עקב צירוף קצה לא הומולוגי לבין כריתה ארוכת טווח של רקומבינציה הומולוגית באמצעות נוגדן אנטי PCNA כדי לזהות תאים העוברים את שלב ה- S.
PCNA בולט בגרעין ומגיע לביטוי מקסימלי במהלך שלב ה- S של מחזור התא עם כתמים עזים למדי. התוצאה בערכים משורטטת לאחר מכן כ- scatterplot כדי להפלות בין גרעינים שליליים PCNA חיובי PCNA ו- PCNA. התוצאות השליליות של PCNA מוסרות מערכת הנתונים כדי לאפשר ניתוח מבוסס עוצמה של BrdU בגלל אות BrdU נמוך ללא קשר למצב.
הגרעינים השליליים PCNA מכילים עוצמה משולבת בסיסית של מוקדי BrdU של 900 יחידות שרירותיות וערך זה מגיע ל -1, 800 AU בגרעינים חיוביים של PCNA. במצב בקרת siRNA, העוצמה המשולבת של מוקדי BrdU לכל גרעין היא כ 1, 500 AU בגרעין חיובי PCNA. לאחר נוקאאוט יעיל של PARP-1 באמצעות siRNA, עלייה משמעותית בעוצמת מוקדי BrdU לכ 1, 900 AU נצפתה.
טכניקה זו יכולה לספק תובנות מרכזיות על השלב הראשון של רקומבינציה הומולוגית, ובכך לסייע בזיהוי אם חלבון מעורב בשלב הראשון של מסלול התיקון. זמן הדגירה עבור מאגרי טרום החילוץ חייב להישמר בקפדנות. חשיפה יתר למאגרים אלה תגרום לניתוק תאים מוגזם ולאות רקע מוגבר.
