Este protocolo permite na quantificação de celulose do DNA e ressecção após danos no DNA. A principal vantagem desta técnica é a marcação do ciclo celular que restringe as células à fase S e G2, garantindo que o sinal de bromodeoxyuridina resulte do DNA e da ressecção. Demonstrando o procedimento estarão Jean-Yves Masson, um dos principais investigadores, e Sofiane Y.Mersaoui, pesquisadora de pós-doutorado.
Trabalhando sob um capô de cultura estéril, coloque uma única mancha em cada poço de uma placa de seis poços para quantas condições necessárias. Placa aproximadamente 150.000 células HeLa para transfecção ou tratamento medicamentoso. No terceiro dia, após a incubação noturna com BrdU em uma concentração final de 10 micromolar, irradie as placas com uma dose total de cinco cinzas de irradiação de raios-X.
Após a irradiação, devolva as placas para incubação a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada de óxido de carbono de 5% por três horas. Para pré-extração, aspire o meio e lave cuidadosamente as células duas vezes com PBS. Depois de remover o PBS, adicione dois mililitros de tampão de pré-extração A e incuba as células a quatro graus Celsius no gelo por 10 minutos.
Após 10 minutos, aspire tampão A, adicione dois mililitros de citoesqueleto descascando tampão B, e repita a incubação. Em seguida, aspire cuidadosamente o tampão B e lave as células com PBS. Após aspirar PBS, fixe as células adicionando dois mililitros de 4% de paraformaldeído sob a capa química.
Após a remoção do paraformaldeído e lava com PBS, cubra as tampas com metanol 100% frio para incubação a menos 20 graus Celsius por cinco minutos e lave as tampas duas vezes com PBS. Para permeabilização, incubar as células com dois mililitros de PBS contendo 0,5% Tritan X-100 à temperatura ambiente. Após 15 minutos, lave as tampas três vezes com dois mililitros de PBS.
Para imunostaining, adicione dois mililitros de tampão de bloqueio a cada poço. Após uma hora de incubação, adicione 100 microliters de solução de anticorpos primários a cada deslizamento de cobertura. Use pinças para cobrir as tampas com parafilm quadrado e posicione cuidadosamente o parafilme para não criar bolhas.
Em seguida, cubra a placa em papel alumínio e incuba o anticorpo primário durante a noite a quatro graus Celsius em uma câmara umidificada. No dia seguinte, remova as praças de parafilm e lave as tampas três vezes com dois mililitros de PBS. Após a lavagem, adicione 100 microliters de solução de anticorpos secundários em cada tampa e cubra as tampas com um quadrado de parafilm, como demonstrado.
Incubar o anticorpo secundário à temperatura ambiente por uma hora e proteger a placa da luz usando papel alumínio. Em seguida, lave as tampas três vezes com dois mililitros de 1X PBS. Para coloração nuclear, adicione dois mililitros de solução DAPI a cada deslizamento de cobertura e lave as tampas com PBS.
Adicione 10 a 20 microlitros de meio de montagem específico do IF em slides de microscópio. Use a agulha ou pinça fina para levantar a tampa da parte inferior do poço. Limpe cuidadosamente o excesso de líquido tocando uma borda suavemente em uma toalha de papel e monte as tampas em slides de microscópio.
Para aquisição e análise de imagens, importe esses arquivos para o CellProfiler e analise-os usando o pipeline de contagem de manchas. Identifique o objeto principal para identificar os focos usando as configurações descritas no manuscrito do texto e medir a intensidade. Imagens representativas da formação de focos de desoxyuridina 5-bromo-2-prime-desoxyuridina e a proliferação de manchas de antígeno nuclear celular após a irradiação são mostradas aqui.
As faixas de DNA geradas foram visualizadas como focos distintos. Os focos identificados foram então quantificados e expressos como a intensidade total integrada da coloração bromodeoxyuridina nos núcleos. A co-coloração mostrou diferenciação entre a ressecção de curto alcance devido à junção final não homólogoa e a ressecção de longo alcance da recombinação homóloga usando um anticorpo anti-PCNA para identificar células que passam pela fase S.
O PCNA é proeminente no núcleo e atinge a expressão máxima durante a fase S do ciclo celular com uma coloração bastante intensa. O resultado em valores são então plotados como uma estratégia de dispersão para discriminar entre os núcleos negativos PCNA positivo e PCNA. Os resultados negativos do PCNA são removidos do conjunto de dados para permitir a análise baseada em intensidade de BrdU devido ao sinal de BrdU baixo, independentemente da condição.
Os núcleos negativos do PCNA abrigam uma intensidade basal integrada de focos brdU de 900 unidades arbitrárias e esse valor chega a 1.800 UA em núcleos positivos pcna. Na condição de controle do siRNA, a intensidade integrada de focos de BrdU por núcleo é de aproximadamente 1.500 UA nos núcleos positivos do PCNA. Após um knockdown eficiente de PARP-1 utilizando um siRNA, observou-se um aumento significativo na intensidade dos focos brdU para aproximadamente 1.900 UA.
Esta técnica pode fornecer insights-chave sobre o primeiro estágio da recombinação homólogo, ajudando assim a identificar se uma proteína está envolvida no primeiro passo da via de reparo. O tempo de incubação dos buffers de pré-extração deve ser estritamente mantido. A exposição excessiva a esses buffers resultará em descolamento excessivo de células e aumento do sinal de fundo.
