このプロトコルは、DNAのセルロ定量およびDNA損傷後の切除を可能にする。この技術の主な利点は、細胞をS期およびG2期に制限し、DNAおよび切除から生じるブロモデオキシウリジンシグナルを確実にする細胞周期マーキングである。この手順を実証するのは、主任研究者のJean-Yves Massonとポスドク研究者のSofiane Y.Mersaouiです。
滅菌培養フードの下で作業し、必要な数の条件のために、6ウェルプレートの各ウェルに単一のカバースリップを置きます。トランスフェクションまたは薬物処理のために約150,000個のHeLa細胞をプレートする。3日目に、終濃度10マイクロモルのBrdUとの一晩インキュベーションに続いて、5グレイのX線照射の総用量でプレートを照射する。
照射後、プレートを37°Cで5%の二酸化炭素加湿インキュベーターに3時間戻してインキュベートする。予備抽出のために、培地を吸引し、PBSで細胞を2回注意深く洗浄する。PBSを除去した後、2ミリリットルの抽出前バッファーAを加え、細胞を氷上で摂氏4度で10分間インキュベートする。
10分後、吸引バッファーA、細胞骨格剥離バッファーBを2ミリリットル加え、インキュベーションを繰り返した。その後、バッファーBを注意深く吸引し、PBSで細胞を洗浄する。PBSを吸引した後、化学フードの下に2ミリリットルの4%のパラホルムアルデヒドを加えて細胞を固定する。
パラホルムアルデヒドを除去してPBSで洗浄した後、カバースリップを100%冷たいメタノールで覆い、マイナス20°Cで5分間インキュベートし、カバースリップをPBSで2回洗浄します。透過処理のために、細胞を0.5%Tritan X-100を含む2ミリリットルのPBSと共に室温でインキュベートする。15分後、カバースリップを2ミリリットルのPBSで3回洗う。
免疫染色のために、各ウェルに2ミリリットルのブロッキングバッファーを加える。1時間のインキュベーション後、100マイクロリットルの一次抗体溶液を各カバースリップに加える。ピンセットを使用してカバースリップを正方形のパラフィルムで覆い、泡を作らないようにパラフィルムを慎重に配置します。
次いで、プレートをアルミニウム箔で覆い、加湿チャンバー内で一次抗体を摂氏4度で一晩インキュベートする。翌日、パラフィルムの正方形を取り除き、カバースリップを2ミリリットルのPBSで3回洗う。洗浄後、各カバースリップに100マイクロリットルの二次抗体溶液を加え、実証されているように正方形のパラフィルムでカバースリップを覆う。
二次抗体を室温で1時間インキュベートし、ホイルを使用してプレートを光から保護します。その後、カバースリップを2ミリリットルの1X PBSで3回洗ってください。核染色の場合は、各カバースリップに2ミリリットルのDAPI溶液を加え、カバースリップをPBSで洗浄します。
顕微鏡スライドに10~20マイクロリットルのIF特異的マウント媒体を加えます。針または細かいピンセットを使用して、カバースリップを井戸の底から持ち上げます。ペーパータオルの片方の端を軽く叩いて余分な液体を慎重に拭き取り、カバースリップを顕微鏡スライドに取り付けます。
画像の取得と分析を行うには、これらのファイルを CellProfiler にインポートし、スペックルカウントパイプラインを使用して分析します。テキスト原稿に記載されている設定を使用して病巣を識別するための主要なオブジェクトを特定し、強度を測定します。照射後の5-ブロモ-2-プライムデオキシウリジン病巣形成および増殖細胞核抗原染色の代表的な像をここに示す。
生成された一本鎖DNAトラックを、別個の病巣として可視化した。次いで、同定された病巣を定量化し、核におけるブロモデオキシウリジン染色の総積分強度として表した。共染色は、S期を経る細胞を同定するために抗PCNA抗体を用いた非相同末端結合による短距離切除と相同組換えの長距離切除との間の分化を示した。
PCNAは核内で顕著であり、細胞周期のS期に極めて強い染色で最大発現に達する。次に、値の結果を散布図としてプロットし、PCNA 陽性核と PCNA 負核を判別します。PCNA 陰性の結果はデータセットから削除され、条件に関係なく BrdU 信号が低いため、BrdU 強度ベースの解析が可能になります。
PCNA負性核は、900単位のBrdU病巣の基礎積分強度を保有し、この値はPCNA正核において1,800AUに達する。siRNA対照条件において、核当たりのBrdU病巣の集積強度は、PCNA陽性核において約1,500AUである。siRNAを用いたPARP−1の効率的なノックダウンの後、BrdU病巣の強度の約1,900AUへの有意な増加が観察された。
この技術は、相同組換えの第1段階に関する重要な洞察を提供し、したがって、タンパク質が修復経路の第1段階に関与しているかどうかを同定するのに役立つ。抽出前バッファーのインキュベーション時間は厳密に保持する必要があります。これらのバッファーへの過剰暴露は、過剰な細胞剥離およびバックグラウンドシグナルの増加をもたらす。
