이 프로토콜은 DNA 손상에 따라 DNA 및 절제술의 셀룰로 정량화를 허용합니다. 이 기술의 주요 장점은 세포를 S 및 G2 단계로 제한하는 세포 주기 표시로 DNA 및 절제에서 브로모톡옥우리딘 신호 결과를 보장합니다. 절차를 보여주는 것은 장 이브 매슨, 주요 조사자, 그리고 소피아네 Y.Mersaoui, 박사 후 연구원이 될 것입니다.
멸균 배양 후드 아래에서 작업하면 필요한 만큼의 조건에 따라 6웰 플레이트의 각 웰에 하나의 커버슬립을 배치합니다. 약 150, 000 HeLa 세포를 경질 또는 약물 치료를 위한 플레이트. 셋째 날, BrdU와의 하룻밤 잠복에 이어 10 마이크로몰라의 최종 농도에서 총 5개의 회색의 X선 조사 용량으로 플레이트를 조사합니다.
조사 후, 3 시간 동안 5 %의 탄소 산화가중증 인큐베이터에서 37섭씨37도에서 배양판을 반환하십시오. 사전 추출을 위해, 매체를 흡인하고 PBS로 세포를 두 번 조심스럽게 씻으세요. PBS를 제거한 후, 추출 전 버퍼 A의 2밀리리터를 추가하고 10분 동안 얼음에 섭씨 4도에서 세포를 배양합니다.
10분 후 흡인 버퍼 A는 사이토스켈레톤 스트리핑 버퍼 B의 2밀리리터를 추가하고 인큐베이션을 반복합니다. 그런 다음 조심스럽게 버퍼 B를 흡인하고 PBS로 세포를 씻으세요. PBS를 달린 후 화학 후드 아래에 파라포름알데히드의 4 %의 2 밀리리터를 추가하여 세포를 수정하십시오.
파라포름알데히드를 제거하고 PBS로 세척한 후, 커버립을 100% 차가운 메탄올로 덮고 5분간 영하 20도의 배양을 위해 커버립을 덮고 PBS로 커버립을 두 번 씻습니다. 투과성화를 위해 실온에서 0.5%트리탄 X-100을 함유한 PBS의 2밀리리터로 세포를 배양한다. 15분 후, PBS 의 2 밀리리터로 커버립을 세 번 씻습니다.
면역 염색의 경우 각 웰에 블로킹 버퍼 2밀리리터를 추가합니다. 1시간 동안 잠복한 후 각 커버슬립에 1차 항체 용액 100마이크로리터를 추가합니다. 핀셋을 사용하여 커버립을 정사각형 파라필름으로 덮고 파라필름을 조심스럽게 배치하여 거품을 만들지 마십시오.
그런 다음 알루미늄 호일로 판을 덮고 가습 챔버에서 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 1 차 항체를 배양합니다. 다음 날, 파라필름 사각형을 제거하고 PBS의 두 밀리리터로 커버립을 세 번 세척합니다. 세척 후 각 커버슬립에 100마이크로리터의 이차 항체 용액을 추가하고 설명한 대로 파라필름 사각형으로 커버커버립을 덮습니다.
이차 항체를 실온에서 1시간 동안 배양하고 호일을 사용하여 빛으로부터 플레이트를 보호합니다. 그런 다음 1X PBS의 2 밀리리터로 커버립을 세 번 씻습니다. 핵 염색의 경우 각 커버슬립에 DAPI 용액 2밀리리터를 추가하고 PBS로 커버립을 세척합니다.
현미경 슬라이드에 IF 특이 장착 배지10~20마이크로리터를 추가합니다. 바늘이나 미세 핀셋을 사용하여 우물 바닥에서 덮개 슬립을 들어 올립니다. 종이 타월에 한 가장자리를 부드럽게 두드리고 현미경 슬라이드에 커버립을 장착하여 여분의 액체를 조심스럽게 제거합니다.
이미지 수집 및 분석을 위해 이러한 파일을 CellProfiler로 가져오고 반점 계수 파이프라인을 사용하여 분석합니다. 텍스트 원고에 설명된 설정을 사용하여 foci를 식별하고 강도를 측정하기 위해 기본 개체를 식별합니다. 5-브로모-2-프라임-데옥시리딘 포시 형성 및 증식 세포 핵 항원 염색 의 대표적인 이미지는 조사 후 여기에 도시된다.
생성된 단일 좌초 DNA 트랙은 뚜렷한 초점으로 시각화되었다. 확인된 포시는 그 때 정량화되고 핵에서 브로모톡옥수리딘 염색의 총 통합 강도로 표현되었다. 공동 염색은 비동상종 결합및 항PCNA 항체를 이용하여 동종재조합의 장거리 절제술으로 인한 단거리 절제술 간의 분화를 보여 S상을 통과하는 세포를 식별하였다.
PCNA는 핵에서 두드러지며 세포 주기의 S 단계 동안 매우 강렬한 염색을 통해 최대의 발현에 도달한다. 그 결과 값은 PCNA 양성 핵과 PCNA 음성 핵을 구별하기 위한 산란플롯으로 플롯됩니다. PCNA 음의 결과는 조건에 관계없이 낮은 BrdU 신호로 인해 BrdU 강도 기반 분석을 허용하기 위해 데이터 집합에서 제거됩니다.
PCNA 음성 핵은 900 임의 단위의 BrdU 초점의 기저 통합 강도를 항구하고 이 값은 PCNA 양성 핵에서 1, 800 AU에 도달합니다. siRNA 대조조건에서, 핵당 BrdU foci의 통합 강도는 PCNA 양성 핵에서 약 1, 500 AU이다. siRNA를 사용하여 PARP-1의 효율적인 낙폭 후, BrdU foci의 강도가 약 1, 900 AU로 크게 증가하는 것을 관찰했다.
이 기술은 동종 재조합의 첫번째 단계에 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다, 따라서 단백질이 수리 통로의 첫번째 단계에서 관련되어 있는지 확인하는 것을 돕습니다. 추출 전 버퍼의 인큐베이션 시간은 엄격하게 유지되어야 합니다. 이러한 버퍼에 과도하게 노출되면 과도한 세포 분리 및 증가된 배경 신호가 발생합니다.
