Этот протокол позволяет проводить в целлюло количественную оценку ДНК и резекцию после повреждения ДНК. Основным преимуществом этого метода является маркировка клеточного цикла, которая ограничивает клетки фазами S и G2, обеспечивая результаты сигнала бромодезоксиуридина из ДНК и резекции. Продемонстрировать процедуру будут Жан-Ив Массон, главный исследователь, и Софиан Я. Мерсауи, постдокторант.
Работая под стерильным культурным капюшоном, поместите один крышку в каждую скважину из шестилуночной пластины для любого необходимого количества условий. Пластина приблизительно 150 000 клеток HeLa для трансфекции или медикаментозного лечения. На третий день, после ночной инкубации с BrdU в конечной концентрации 10 микромоляров, облучают пластины общей дозой пяти серых рентгеновских облучений.
После облучения верните пластины для инкубации при температуре 37 градусов Цельсия в 5%-ный увлажненный инкубатор оксида углерода в течение трех часов. Для предварительной экстракции аспирируйте среду и тщательно промывайте клетки дважды PBS. После удаления PBS добавьте два миллилитра предварительно экстракционного буфера A и инкубируйте клетки при четырех градусах Цельсия на льду в течение 10 минут.
Через 10 минут аспирируют буфер А, добавляют два миллилитра цитоскелета, зачищающего буфер В, и повторяют инкубацию. Затем осторожно аспирируйте буфер B и промывайте клетки PBS. После аспирации PBS зафиксируйте клетки, добавив два миллилитра 4% параформальдегида под химический капот.
После удаления параформальдегида и промывки PBS накройте крышки 100% холодным метанолом для инкубации при минус 20 градусах Цельсия в течение пяти минут и дважды промойте крышки PBS. Для пермеабилизации инкубируют клетки двумя миллилитрами PBS, содержащими 0,5% тритана X-100 при комнатной температуре. Через 15 минут трижды вымойте крышки двумя миллилитрами PBS.
Для иммуноокрашения добавьте в каждую лунку по два миллилитра блокирующего буфера. После одного часа инкубации добавляйте 100 микролитров раствора первичного антитела к каждому покровному листу. Используйте пинцет, чтобы покрыть крышки квадратным парапленком и аккуратно расположить парапленку, чтобы не создавать пузырьков.
Затем накройте пластину алюминиевой фольгой и инкубируйте первичное антитело в течение ночи при четырех градусах Цельсия в увлажненной камере. На следующий день снимите квадраты парапленки и трижды промойте крышки двумя миллилитрами PBS. После промывки добавьте 100 микролитров раствора вторичного антитела на каждый покровный лист и покройте крышки квадратом парапленки, как показано на рисунке.
Инкубируют вторичное антитело при комнатной температуре в течение одного часа и защищают пластину от света с помощью фольги. Затем трижды вымойте крышки двумя миллилитрами 1X PBS. Для ядерного окрашивания добавьте два миллилитра раствора DAPI в каждый обшивочный лист и промойте крышки PBS.
Добавьте от 10 до 20 микролитров специфичной для ПЧ монтажной среды на предметные стекла микроскопа. Используйте иглу или тонкий пинцет, чтобы поднять крышку со дна колодца. Осторожно смойте лишнюю жидкость, осторожно постучав одним краем по бумажному полотенцу, и установите обшивки на предметные стекла микроскопа.
Для получения и анализа изображений импортируйте эти файлы в CellProfiler и проанализируйте их с помощью конвейера подсчета пятен. Определите первичный объект для идентификации очагов с помощью настроек, описанных в текстовой рукописи, и измерьте интенсивность. Здесь показаны репрезентативные изображения образования 5-бром-2-прайм-дезоксиуридиновых очагов и окрашивания клеточного ядерного антигена после облучения.
Сгенерированные одноцепочечные дорожки ДНК были визуализированы как отдельные очаги. Затем идентифицированные очаги количественно оценивали и выражали как общую интегральную интенсивность окрашивания бромодеоксиуридина в ядрах. Совместное окрашивание показало дифференциацию между резекцией короткого диапазона из-за негомологичного соединения конца и длинной резекцией гомологичной рекомбинации с использованием антитела против PCNA для идентификации клеток, проходящих через S-фазу.
PCNA занимает видное место в ядре и достигает максимальной экспрессии во время S-фазы клеточного цикла с довольно интенсивным окрашиванием. Результат в значениях затем строится в виде диаграммы рассеяния для различения положительных и отрицательных ядер PCNA. Отрицательные результаты PCNA удаляются из набора данных, чтобы обеспечить анализ на основе интенсивности BrdU из-за низкого сигнала BrdU независимо от состояния.
Отрицательные ядра PCNA имеют базальную интегральную интенсивность очагов BrdU 900 произвольных единиц, и это значение достигает 1 800 AU в положительных ядрах PCNA. В состоянии контроля siRNA интегральная интенсивность очагов BrdU на ядро составляет приблизительно 1 500 а.е. в положительных ядрах PCNA. После эффективного нокдауна PARP-1 с использованием siRNA наблюдалось значительное увеличение интенсивности очагов BrdU примерно до 1 900 а.е.
Этот метод может дать ключевое представление о первой стадии гомологичной рекомбинации, тем самым помогая определить, участвует ли белок в первой стадии пути восстановления. Инкубационное время для буферов предварительной экстракции должно строго соблюдаться. Чрезмерное воздействие этих буферов приведет к чрезмерному отсоединению клеток и увеличению фонового сигнала.
