蛍光相関分光法の最良の原理であるFCSは、1970年代に最初に発明されました。1990年代には、共焦点装置顕微鏡と組み合わせることで、FCSの重要かつ多くの改良が確立されました。それ以来、FCSは、分子相互作用やタンパク質凝集解析など、多くの化学・ウイルス治療用途に使用されてきました。
タンパク質凝集は神経変性疾患の特徴である。蛍光輝度は、拡散特性によって説明される分子サイズの作用における単一粒子である。タンパク質凝集を測定する際には、分子の予測ライフサイクルを決定できるだけでなく、ホモまたはヘテロ重合も区別できるため、非常に重要です。
ここでは、細胞ライセートおよび生細胞におけるFCSを用いた凝集型タンパク質に関連する筋萎縮性側索硬化症の拡散を測定する手順を紹介する。正常な成長媒体の中で快適に坐っているNeuro2a細胞を成長する100ミリメートルプラスチック皿を準備する。細胞の合流を確認します。
メディアを取り外します。3.5ミリリットルのトリプシンEDTA溶液を3番目のカートリッジ皿に加え、摂氏37度で1分間インキュベートします。9.5ミリリットルの正常成長培地を皿に加え、それらを中断します。
細胞懸濁液をトリパンブルーと混合して死細胞を染色する。セルカウントスライドにサスペンションを追加します。セル カウンタを使用するか、手動でセルの数をカウントします。
ライブセル番号とその生存率を確認してください。1ミリリットル当たり5の電力に1.0倍10倍にカウントされた媒体で細胞を希釈します。生細胞測定用の細胞リシスまたは成長空間皿用の35ミリメートルプラスチック皿に2ミリリットルの細胞懸濁液を加えます。
1日摂氏37度でインキュベートします。翌日、プラスミドDNAとトランスフェクション試薬の混合物を調製する。細胞数培地にトランスフェクション混合物を加え、細胞を24時間インキュベートします。
一日後。日常的な顕微鏡を使用してGFP表現を確認します。あなたは細胞の中で非常に明るいTDP25成分体を見ることができます。
細胞の分解は生化学的なベンチで行われるべきである。皿の中の媒体を取り除きます。25°CでPBSを2ミリリットル加え、培地として洗浄します。
PBS を取り出します。砕いた氷の上にアルミニウム板の上に皿を置きます。すぐに、200マイクロリットルのライシスバッファーを皿に加えます。
セルスクレーパーを使用して皿を削ります。新しい1.5ミリメートルチューブの未溶解細胞デブリで溶解物を回収します。摂氏4度でリセートを遠心分離します。
ライブセル測定の場合は、測定前に新しい測定に培地を交換してください。位相コントラスト顕微鏡を使用して細胞の取り付けを確認します。また、蛍光顕微鏡を用いてGFPの発現を確認してください。
共焦点顕微鏡結合FCSシステムを使用します。488ナノメートルのレーザーをオンにします。少なくとも30分間システムを安定させます。
光パスを設定します。488ナノメートルのレーザーをインスタントライトに使用します。適切なビームスプリッターと二色性計を使用してください。
また、蛍光フューザー。通常、キャリブレーションと溶液測定にはカバーグラスチャンバーを使用します。慎重に、カバーガラスチャンバーを取ります。
ガラス表面をレンズのスクリーニング用紙に置きます。FCSキャリブレーションを流します。同様にロダミン6G溶液を追加します。
目的に超純水を追加します。油は使用しないでください。顕微鏡のステージにチャンバーを置きます。
ステージを適切な位置に移動します。ピンホール調整を作成し、ピンホール調整ウィザードを開きます。フォトン数の割合を、x 方向のピンホールの粗い動きとして監視します。
最も明るい位置は正しく決定されました。次に、光子のカウントレートを微細な動きとして監視します。最も明るい位置は、X 方向のピンホール位置と判定されました。
同様に、ピンホールの最も明るい位置で y 方向を検索します。y方向の最も明るい位置も決定されました。ピンホールの x と y の位置を合成します。
毎日の測定の前にピンホールの位置を調整することをおしいです。ライブパスが変更された場合、ピンホールの位置を再調整する必要があります。カウント率を作成し、電話の数を監視します。
CPM モニタリング モードに変更します。CPM 値が最高になるように、実行したオブジェクトの補正リングをカウントします。カウント率ウィンドウを閉じます。
ローダミン6G溶液測定から開始します。測定が完了したら、フィットをクリックしてカーブフィッティング解析を実行します。古い相関関数の適合のためのモデルを選択します。
ローダミン6Gの場合、トリプレット状態の1成分3次元拡散のモデルを選択します。赤い線を動かしてフィッティング開始時間を設定します。[すべてフィット]をクリックして、継ぎ手計算を開始します。
適合偏差を確認します。側面がゼロの周りに、転記され、負であることを確認します。適合値を確認します。
拡散時間が20~30マイクロ秒の範囲であることを確認します。さらに、構造パラメータは4から8までである。フィットパネルを開き、測定するモデルを選択します。
適合パネルで、サンプルのモデルに同じ構造パラメータ値を入力します。型が固定型に設定されていることを確認します。細胞のライセートのGFP-TDP25測定。
リセートをカバーグラスチャンバーに入れます。蓋をして、ライセートの乾燥を避けます。薄いシェーディングのステージのふたを置きます。
取得パネルで、レーザーパワー、測定時間、および繰り返しを設定します。取得を開始します。スパイクが観察された。
スパイクが再び観察された。スパイクは、検出体を通過した明るい分子を示しています。スパイクは可溶性オリゴマーまたは凝集体を示す。
カーブ フィット解析を実行するためのフィットを作成します。トリプレット状態の 2 成分、3 次元拡散のモデルを選択します。フィッティング開始時刻を設定します。
[すべてフィット]をクリックします。適合値を確認します。SOD1-G85Rは、ライブセル内のGFP測定でタグ付けされています。
溶液測定とは異なり、ヒートステージインキュベーターを使用することをお勧めします。顕微鏡ステージに細胞培養皿をセットします。眼を使用してフォーカスと位置を確認します。
測定セルを選択します。高速スキャンモードを使用して、セルの位置を拡大して調整します。低速スキャン速度モードを使用してセルのスナップショットを取得します。
位置ツールを使用して、FCS測定位置を選択します。十字線は測定位置を示します。測定を開始します。
光子数の割合記録のわずかな減少は、GFPの光の切り落としを示唆しています。カーブのフィッティングを実行します。細胞ライセートにおけるGFP-TDP25の代表結果が示される。
トップグラフは、フォトン数の記録を示しています。矢印があるところにはスパイクがあり、可溶性オリゴマーと凝集体が示唆されています。中央のグラフは、古い相関関数を表します。
灰色の線は低い、古い相関関数を示しています。マゼンタラインは適合関数を示します。点線は、フィッティングの開始時間と終了時間を示します。
下の表は適合値を示しています。次に、生細胞におけるSOD1-G85R-GFPの代表結果を示す。上のグラフは、フォトン数の記録を表します。
記録された光子数の減少率が徐々に観察され、異なる測定のためのGFP成長の光化が示唆された。これは、生細胞の拡散速度が遅いためです。中央のグラフは、SOD1の古い相関関数を表します。
灰色の線は低い、古い相関関数を示しています。マゼンタラインは適合関数を示す。点線は、フィッティングを使用した開始時間と終了時間を示します。
下の表は適合値を示しています。ここでは、細胞ライセートにおけるTDP-25関連するすべての細胞からの拡散を測定し、FCSを使用して生細胞内のSOD1の全変異体を測定するこの手順を示します。細胞溶解物中の可溶性オリゴマーおよび凝集は、スパイクまたはバーストとしてしばしば観察することができる。
一方、生細胞では、おそらく明白な生きている構造を除いて、そのようなスパイクはほとんど観察されない。ゆっくりと拡散する種の変異体SOD1は、SOD1ホモ重合などの単一粒子の明るさを意味します。ここに示す手順はシンプルで価値があります。
FCS には放射線がなく、直接休止状態です。それはちょうどあなたと私たちの想像力の共感です。
