Лучший принцип спектроскопии корреляции флуоресценции, FCS, был изобретен первоначально в 1970-х годах. В 1990-х годах, важные и многие улучшения для FCS была создана путем объединения с конфокальные микроскопии аппарата. С тех пор FCS используется для многих химических и вирусных приложений лечения, таких как молекулярные взаимодействия и анализ агрегации белка.
Агрегация белка является отличительной чертой нейродегенеративных расстройств. Яркость флуоресценции – это одиночные частицы в действии молекулярных размеров, которые объясняются диффузионные свойствами. Это очень важно в измерении агрегации белка, потому что он может определить прогнозируемые жизненные циклы молекул, но и различать гомо или гетеро полимеризации.
Здесь мы вводим процедуру измерения диффузии бокового амиотрофического склероза, связанного с агрегированным протеином формы с использованием FCS в клеточных лизорах и живых клетках. Приготовьте 100-миллиметровую пластиковую тарелку, растущую в клетке Neuro2a, удобно сидящую в нормальной среде роста. Подтвердите слияние клеток.
Удалите носитель. Добавьте 3,5 миллилитров раствора Трипсин-ЭДТА в третье блюдо картриджа и инкубировать их при 37 градусах по Цельсию в течение одной минуты. Добавить 9,5 миллилитров нормального роста среды в блюдо и приостановить их.
Подвеска клетки смешана с трипан-синим цветом, чтобы испачкать мертвые клетки. Добавьте подвеску к слайду подсчета ячееок. Подсчитайте количество ячеек с помощью счетчика ячеек или вручную.
Проверьте живой номер ячейки и их жизнеспособность. Разбавить ячейку в подсчитанной среде в 1,0 раза 10 до мощности 5 на миллилитр. Добавьте два миллилитров клеточной суспензии в 35-миллиметровую пластиковую тарелку для клеточного лиза или пространство роста для измерения живых клеток.
Инкубировать блюдо при 37 градусах по Цельсию в течение одного дня. На следующий день приготовьте смесь плазмидной ДНК и трансфектных реагентов. Добавьте смесь трансфекции в клеточную среду и инкубировать клетки в течение 24 часов.
Один день спустя. Проверьте выражение GFP с помощью обычного микроскопа. Вы можете увидеть очень яркие тела ингредиента TDP25 в клетках.
Клеточныйлиз следует проводить на биохимической скамейке. Удалите среду в блюдо. Добавить два миллилитров PBS при 25 градусах по Цельсию, чтобы мыть как средство.
Удалите PBS. Поместите блюдо на алюминиевую тарелку поверх дробленого льда. Немедленно добавьте буфер лиза микролитера 200 в тарелку.
Очисти блюдо с помощью клеточного скребка. Восстановите лизат с неоконсеримым клеточным мусором в новой 1,5-миллиметровой трубке. Центрифуга лисировать при четырех градусах по Цельсию.
Для измерения живых клеток замените носитель на свежий перед измерением. Проверьте вложение клеток с помощью фазово-контрастного микроскопа. Кроме того, проверьте выражение GFP с помощью флуоресцентной микроскопа.
Используйте конфокальцированную систему FCS, комбинированную с микроскопом. Включите 488 нанометровый лазер. Стабилизировать систему, по крайней мере, в течение 30 минут.
Настройка оптического пути. Используйте 488 нанометровый лазер для мгновенного света. Используйте соответствующий пучок сплиттера и дихроических метров.
А также, флиоресценции предохранители. Как правило, мы будем использовать крышки камер для калибровки и измерения раствора. Осторожно, возьмите крышку камеры.
Поместите стеклянную поверхность на скрининговую бумагу объектива. Налейте калибровку FCS. Добавить раствор родамин 6G, а также.
Добавьте ультрачистую воду на цель. Не используйте масло. Установите камеру на сцене микроскопа.
Перемести сцену в соответствующее положение. Создайте регулировку пинхол и откройте мастер регулировки пинхол. Мониторинг скорости подсчета фотона как грубого движения пинхол для x-направления.
Самая яркая позиция была правильно определена. Далее, контролировать скорость подсчета фотона, как тонкое движение. Самая яркая позиция была успешно определена Это положение пинхол для X-направления.
Точно так же ищите самое яркое положение пинхол для направления y. Также была успешно определена самая яркая позиция по у-направлению. Соединение x и y положение пинхол.
Лучше настроить положение пинхол перед каждым днем измерения. Когда живой путь изменен, положение пинхол должно быть отрегулировано снова. Создайте скорость подсчета и отслеживайте скорость подсчета телефона.
Изменение режима мониторинга CPM. Подсчитайте кольцо коррекции объекта, который вы запустили, чтобы значение CPM было самым высоким. Закройте окно скорости подсчета.
Начните с измерения раствора Rhodamine 6G. После завершения измерения щелкните припадок для выполнения анализа кривой установки. Выберите модель для установки старой функции корреляции.
Для Rhodamine 6G выберите модель для 1-компонентной трехмерной диффузии с тройным состоянием. Установите подходящее время начала, перемещая красную линию. Нажмите Fit All, чтобы начать подходящий расчет.
Проверьте пригонку отклонения. Убедитесь, что стороны размещены и отрицательные, около нуля. Проверьте установленные значения.
Убедитесь, что время диффузии примерно в диапазоне от 20-30 микросекунд. Кроме того, структурный параметр составляет от четырех до восьми. Откройте подгонку панели, и выбрать модель для измерения.
Введите то же структурное значение параметра в модели для образца в пригонка панели. Убедитесь, что тип должен быть установлен как фиксированный. Измерение GFP-TDP25 в лизации клеток.
Поместите лисат в камеру крышки. Поместите крышку, чтобы избежать высыхания лисата. Поместите крышку сцены для светлого затенения.
В панели приобретения установите мощность лазера, время измерения и его повторения. Начните приобретение. Наблюдался всплеск.
Снова наблюдался всплеск. Шип указывает на яркие молекулы, проходят через тело обнаружения. Спайки указывают на растворимые олигомеры или агрегаты.
Создайте пригонку для выполнения анализа установки кривой. Выберите модель для 2-компонентной трехмерной диффузии с тройным состоянием. Установите подходящее время начала.
Нажмите Fit All. Проверьте установленные значения. SOD1-G85R помечены измерения GFP в живой клетке.
В отличие от измерения раствора, я рекомендую использовать инкубатор тепловой стадии. Установите клеточное блюдо на сцене микроскопа. Подтвердите фокус и положение с помощью глаз.
Выберите измерительную ячейку. Увеличьте масштаб и отрегулируйте положение ячейки с помощью режима быстрого сканирования. Приобрети снимок ячеек с помощью режима медленного сканирования.
Выберите положение измерения FCS с помощью инструмента Позиции. Перекрестие указывает на измерительное положение. Начало измерения.
Небольшое снижение записи скорости подсчета фотона говорит о фотоотводе GFP. Выполните установку кривой. Показаны репрезентативные результаты GFP-TDP25 в лизации ячеей.
Верхний график запись скорости подсчета фотона. Там, где есть стрелки шип, предлагая растворимые олигомеры и агрегаты. Средний график представляет старую функцию корреляции.
Серая линия показывает низкую, старую функцию корреляции. Пурпурная линия показывает установленную функцию. Пунктирные линии указывают время начала и конца установки.
В нижней таблице показано установленное значение. Далее показаны репрезентативные результаты SOD1-G85R-GFP в живой ячейке. Верхний график представляет собой запись нашей скорости подсчета фотона.
Наблюдалось постепенное снижение зарегистрированной скорости подсчета фотона, что свидетельствует о фотоотчете роста GFP для различных измерений. Это связано с медленной скоростью диффузии в живых клетках. Средний график представляет старую корреляционные функции SOD1.
Серая линия показывает низкую, старую функцию корреляции. Пурпурная линия показывает установленную функцию. Пунктирные линии указывают время начала и конца установки.
В нижней таблице показаны установленные значения. Здесь мы покажем вам эту процедуру для измерения диффузии от каждой ячейки, связанной TDP-25 в лицате клеток и все мутант SOD1 в живых клетках с помощью FCS. Растворимые олигомеры и агрегация в лисате клеток часто можно наблюдать как шипы или очередей.
С другой стороны, в живых клетках такие всплески наблюдаются редко, за исключением, возможно, очевидных живых структур. Медленно диффузных видов мутантов SOD1 добавить среднее яркость для отдельных частиц, таких как SOD1 гомополимеризации внутри для нас. Процедура, показанная здесь, проста и стояща.
FCS не содержит излучения; непосредственно спящее состояние. Это просто ваше и наше воображение сопереживание.
