الهدف العام للمادة الطريقة التالية هو إظهار بروتوكول مفيد لدراسة التفاعلات الحمض النووي الريبي مع البروتينات أو عوامل أخرى باستخدام ملاقط بصرية مقرونة المجهر confocal. وعلى مدى العقد الماضي، تم تطوير عدة تقنيات متطورة للتحقيق في خصائص الجزيئات الكبيرة المفردة. واحدة من هذه التقنيات هي ملاقط بصرية جزيء واحد.
مع الملقط الضوئي الجديد بمساعدة الفلورسينس ، لا يمكن مراقبة القوات المطلوبة فقط للكشف عن جزيئات الحمض النووي الريبي ، وكذلك الأحداث الملزمة أثناء الترجمة بالتفصيل. هنا نركز على القياسات التي تمتد جزيئات الحمض النووي الريبي مع وبدون التعامل مع العوامل التي تنظم الترجمة. كما نوضح كيف يمكن تطبيق هذه التقنية لمراقبة الترجمة باستخدام الريبوسومات المسماة.
سيتم عرض البروتوكول من قبل اثنين من طلاب الدراسات العليا في مجموعتي، لوكاس بيكاريك وستيفان بارك. في هذا الفيديو، سوف نرشدك خلال إعداد وتنفيذ تجربة ملاقط بصرية. كما نحدد سير عمل تحليل البيانات البسيط.
وميزة هذه التقنية هي أنها واضحة وقوية. يتم ربط جزيء بين حبتين ، مربوطة في تركيز أشعة الليزر ، ويمكن قياس التغيير والقوة عند الإزاحة بدقة في ما يسمى بتجارب منحدر القوة. الهياكل الثانوية داخل الحبل تتكشف في قوة معينة اعتمادا على الطاقة الداخلية للجزيء.
ويمكن إجراء مزيد من البحث في هذا الانتقال الدينامي بين هياكل متعددة من خلال قياسات القوة الثابتة. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام الاستخدام الموازي للتصوير الفلوري لتصور الأحداث الملزمة في الوقت الحقيقي. قد يختلف ملف تعريف مسافة القوة المتميز للربط بعد ربط عوامل التعامل المحتملة التي تؤثر على استقراره.
أولا، يجب استنساخ الحمض النووي الريبي ذي الأهمية إلى ناقل الحمض النووي. المنبع والمصب من هذا التسلسل، وهناك حاجة إلى أجزاء إضافية، ومقابض لربط بناء الحمض النووي الحمض النووي الحمض النووي النهائي بين الخرز. وبعد نجاح استنساخ البلازميد وتضخيمه، تجرى ثلاثة ردود فعل مختلفة ل PCR.
لكل تفاعل PCR، اخلط الكواشف وفقا للجدول الأول في البروتوكول. تشغيل PCR في 50 ميكرولتر aliquots في دورة الحرارية المناسبة. أول واحد يؤدي إلى الحمض النووي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل من بناء كله مع المروج T7 للنسخ اللاحقة في المختبر.
ينتج PCR الثاني مقابض رئيسية خمسة. في حين أن نتائج رد الفعل الأخير في مقابض رئيس الوزراء الثلاثة. كل من رئيس الوزراء 5 و 3 مقابض رئيس الوزراء تحتاج إلى أن تكون وصفت وفقا للخرز المستخدمة.
يتم تسمية المقابض الرئيسية الثلاثة أثناء PCR باستخدام التمهيدي العكسي المسمى digoxigenin ، ويجب تسمية المقابض الرئيسية الخمسة في خطوة إضافية من خلال البيوتينيل. يتم تنفيذ البيوتينيل ثلاثية رئيس الوزراء من مقابض رئيس الوزراء الخمسة باستخدام T 40 والبوليميراز. يتم إجراء رد الفعل لمدة ساعة إلى ساعتين في درجة حرارة الغرفة.
بعد ذلك ، نفذ النسخ في المختبر باستخدام T7 polymerase. احتضان رد الفعل في 37 درجة لمدة ساعتين إلى أربع ساعات، اعتمادا على طول الحمض النووي الريبي. في خطوة أخيرة ، يتم إعادة مقابض مع الجيش الملكي النيبالي من النسخ في المختبر للحصول على بناء الحمض النووي والحمض النووي الريبي النهائي مع منطقة واحدة تقطعت بهم السبل من الفائدة بين مقابض تقطعت بهم السبل مزدوجة.
لعلة الهجين الحمض النووي الريبي المطلوب، مزيج مقابض والجيش الملكي النيبالي في العازلة الصلبة. الحرارة، خليط الصلب تصل إلى 85 درجة لمدة 10 دقائق، ومن ثم تبرد ببطء أسفل العينة إلى أربع درجات. مزيج عينة مع 1/10th من حجم ثلاثة خلات الصوديوم الضرس، وثلاثة مجلدات من الإيثانول الجليد الباردة واحتضان ناقص 80 درجة لمدة ساعة على الأقل.
طرد العينات في 15، 000 xg لمدة 30 دقيقة في أربع درجات. تجاهل supernatant وتجفيف بيليه تحت فراغ. يتم تجميد aliquots صغيرة من بيليه resuspended في النيتروجين السائل وأبقى في ناقص 80 درجة حتى يتم استخدامها.
أولا إزالة التبييض من المحاقن وملء مل واحد من المياه الحرة RNase. إضافة 50 ميكرولتر من 0.5 ثيوسلفات الصوديوم الضرس وغسل النظام مع شريط واحد. كن حذرا من أن النظام microfluidic لا يجف لتجنب فقاعات الهواء في النظام.
بعد ذلك ، تجاهل محلول ثيوسلفيت الصوديوم المتبقي واستبدال المحاقن بأخرى جديدة. ثم يغسل مرة أخرى مع ما لا يقل عن 0.5 مل من المياه الحرة RNase. لإعداد النظام البصري للآلة، وضع قطرتين من زيت الغمر على الهدف.
وضع الخلية تدفق في مكان وارتفاع الهدف حتى السائل يمس الخلية تدفق. ثم وضع قطرتين من زيت الغمر على رأس الخلية تدفق. الآن بدوره على فخ وحدة التوجيه والليزر محاصرة.
يتم تعديل الهدف باستخدام أداة الباحث Z من الكاميرات التشخيصية للجهاز. عن طريق تحويل المسمار الصغير، يتم ضبط محور Z إلى منتصف الغرفة بين الانعكاس الثاني والثالث. حيث حلقات الانكسار هي الأكبر.
قم بتبديل كاميرات التشخيص إلى وضع القمر وقلل من الليزر المحاصر إلى حوالي 50٪ ثم خفض المكثف وضبط موضعه حتى ترى ما يقرب من 10 نطاقات ضوئية. تحتوي غرفة القياس على خمس قنوات ، وقبل التجربة ، يجب النظر في إمكانيات إعداد مختلفة. لتجربة بسيطة قوة المنحدر ، والخرز العازلة الخرز هو ترتيب قناة مريحة.
بالنسبة للقياسات مع المركب الرابع ، مثل الريبوسومات الفلورية أو عوامل التعامل ، فإن عامل الخرز والخرز العازل هو ترتيب أفضل ، ولكنه يجعل من الصعب التقاط الخرز. يتم احتضان aliquot من بناء مصقول مع تعليق حبة AD ثلاثة ميكرولتر، واحد مثبطات RNase ميكرولتر، وثمانية ميكرولتر من المخزن المؤقت المقايسة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 20 دقيقة. ثم يتم تخفيف العينة في 500 ميكرولتر المقايسة العازلة ووضعها في القناة المعنية.
بالنسبة للنوع الثاني من الخرز ، يتم خلط 0.8 ميكرولتر من حبات المقايسة مع مل واحد من المخزن المؤقت للمقايسة ويتم إدارته في القناة المقابلة. يتم فتح القنوات وغسلها بضغط منخفض. الآن تشغيل الليزر محاصرة.
للقبض على الخرز ، يتم نقل أشعة الليزر بعيدا عن بعضها البعض ويتم القبض على حبة الزخرف الإعلاني في فخ واحد. بعد ذلك يتم نقل المرحلة إلى قناة حبة SA ويتم القبض على حبة في الفخ الثاني. لتجنب فقدان الخرز، أو للقبض على ثانية واحدة في نفس الفخ، يتم نقل المرحلة إلى قناة المخزن المؤقت ويتم إغلاق جميع القنوات.
في المخزن المؤقت، يتم تنفيذ معايرة اعتراض. يجب تعيين الخرز اشتعلت كنماذج مرئية للقياسات اللاحقة. وينبغي أن تبقى درجة التشابه فوق 90٪ بين القياسات لضمان المقارنة.
وأخيرا، يتم نقل الخرز أقرب معا، ويمكن للمرء أن يبدأ للقبض على حبل واحد. ويتم ذلك نقل الخرز إغلاق لبضع ثوان ثم يغادر ببطء الخرز مرة أخرى. تشكيل الحبل يؤدي إلى زيادة القوة المقاسة عند سحب الخرزين بعيدا عن بعضها البعض.
يمكن التحقق من عدد ونوعية الحبال من خلال العثور على هضبة التمدد الزائد ومقارنة المسار مع السلسلة المشتركة بحرية أو نموذج السلسلة الشبيه بالديدان. يجب أن تكون الهضبة فوق التمدد بين 50 إلى 60 piconewton الحبال واحدة. لإجراء قياسات الفلورسينس، قم بتشغيل الليزر البؤري وعدد الفوتونات على وحدة وآلة ملاقط بصرية.
بعد ذلك، قم بتشغيل ليزر الإثارة من الطول الموجي المطلوب وواجهة البرنامج وتعيين قوة الليزر إلى 5٪ أو أعلى، اعتمادا على الفلوروفور. الآن يمكن أن يبدأ التصوير باستخدام وظائف الصورة أو kymograph من البرنامج. من أجل الحصول على صور مركزة بشكل جيد ، تأكد من أن الطائرة المحورية للمجهر confocal والفخاخ البصرية يتم محاذاتها.
لهذا الغرض، يمكن استخدام autofluorescence من حبات البوليسترين في قناة الليزر الأزرق. تحرك صعودا وهبوطا مع المستوى البؤري للفخاخ البصرية حتى يصل الفلورة التلقائية للخرزات إلى أعلى قطر لها. في هذا الموقف، يمكن الكشف عن إشارات الفلورسينس التي تحدث في جزيء المربوطة.
ومن المهم بالنسبة لكلا الوظيفتين اختيار المناطق المناسبة ذات الاهتمام. يمكن تغيير تكوين المخزن المؤقت للقياس بسهولة إما عن طريق نقل الخرز إلى قنوات مختلفة ، أو عن طريق تغيير المخزن المؤقت المقدم في النظام microfluidic. لتجنب الbleaching الضوئي، دائما إيقاف الليزر الإثارة عند عدم قياس.
غالبا ما يحتوي إخراج البيانات الخام من الجهاز على الكثير من الضوضاء. لذلك ، من أجل مواصلة تحليل البيانات المتناثرة ، يجب على المرء أولا معالجتها مسبقا. الخطوة الأولى هي إلى أسفل عينة وتصفية البيانات مع تمريرة منخفضة بتروورث مرشح، تم الحصول على نتائج جيدة.
بالنسبة لتجارب منحدر القوة ، يجب وضع علامة على الأحداث التي تتكشف في المناطق المقابلة المطوية والمتكشفت من منحنى المسافة الأولى يمكن تركيبها باستخدام سلسلة تشبه الدودة أو نماذج سلسلة مشتركة بحرية. بالنسبة لبيانات القوة الثابتة، يمكن رسم المسافة مع مرور الوقت ومن المفيد إنشاء مخطط بياني لتحديد الشكل السائد في قوة معينة. هنا يظهر أن معلمات التصفية حاسمة للتمييز بين حالات قابلة للطي المختلفة.
لفهم أفضل ما يمكن تحقيقه مع هذه التقنية، وتظهر بعض النتائج التمثيلية. هكذا يبدو منحنى المسافة القياسية للقوة من تجربة منحدر القوة. في هذه الحالة، درسنا عنصر تحويل إطار السارس-كورونا-2.
لاحظنا تتكشف في خطوات متعددة حول 15 piconewton. عندما يتم عكس الاتجاه والخرز تقترب مرة أخرى، الحبل يطوي مرة أخرى في قوة أقل قليلا. عندما قمنا بقياس نفس الحمض النووي الريبي في وجود بروتين ZAP المضاد للفيروسات بإصبع الزنك ، لوحظ نمط مماثل من التكشف.
ولكن الهيكل الثانوي للجيش الملكي النيبالي لم يطوي من قبل. هذا هو مثال جيد لإظهار ما تأثير كبير ربط البروتين يمكن أن يكون على الحركية الجيش الملكي النيبالي. وبالنظر إلى بيانات القوة الثابتة، يمكن إجراء مزيد من التحقيق في الحركيات الآخذة في التكشف.
يتم رسم المسافة مع مرور الوقت لقوى مختلفة ويتم إضافة الرسم البياني للدول المختلفة الملاحظة على اليمين. في 10 piconewton، والجيش الملكي النيبالي هو تماما في حالة مطوية. في 11.5 piconewton فإنه يتحول بين الدول، وفي 13 piconewton الجيش الملكي النيبالي هو بشكل دائم في حالة تتكشف.
ومع ذلك ، عندما تم قياس عنصر تحول إطار السارس كورونا -2 جنبا إلى جنب مع ZAP ، كان الجيش الملكي النيبالي تماما في حالة تتكشف في 11 piconewton ، وحتى أظهرت القليل جدا من الانتقال نحو حالة مطوية في 10 piconewton. يشير هذا إلى أن ZAP يربط إلى عنصر تحويل إطار واحد تقطعت بهم السبل ويمنع تشكيل بنية ثانوية. وأخيرا، سننظر في بعض بيانات الملاقط البصرية إلى جانب المجهر البؤري.
في هذه التجربة، تم استخدام صبغة فلورية تسميات الأحماض النووية التي تقطعت بها السبل مزدوجة، على وجه التحديد مع زيادة القوة. تظهر الكيموغراف أنه مع انتقال الخرز بعيدا عن بعضها البعض ، تزداد كثافة الفلورسينس وتختفي تماما بمجرد أن يتم تمديد الحبل أكثر من اللازم وفواصله. في الشكل الأخير تمت إضافة الريبوسومات المسماة فلوريا من خلال القناة الرابعة.
في هذه التجربة لوحظ ربط الريبوسوم محددة إلى الحبل الجيش الملكي النيبالي. نأمل أن يكون هذا الفيديو قد أعطاك نظرة ثاقبة على الملاقط البصرية وما يمكن القيام به هذه التقنية المذهلة.
