Aşağıdaki yöntem makalesinin genel amacı, konfokal mikroskopi ile birleştirilmiş optik cımbız kullanarak proteinlerle veya diğer faktörlerle RNA etkileşimlerini incelemek için yararlı bir protokol göstermektir. Son on yılda, tek makromoleküllerin özelliklerini araştırmak için çeşitli sofistike teknikler geliştirilmiştir. Bu tekniklerden biri de tek molekülli optik cımbızdır.
Yeni floresan destekli optik cımbızla, sadece RNA moleküllerinin açılmak için gerekli kuvvetlerin yanı sıra çeviri sırasındaki bağlama olayları ayrıntılı olarak izlenebilir. Burada, RNA moleküllerinin çeviriyi düzenleyen faktörlerle ve işlemeden gerildiği ölçümlere odaklanıyoruz. Ayrıca, etiketli ribozomlar kullanılarak çeviriyi izlemek için tekniğin nasıl uygulanabileceğini de göstermektedir.
Protokol, grubumdaki iki yüksek lisans öğrencisi Lukas Pekarek ve Stefan Park tarafından gösterilecek. Bu videoda, optik cımbız deneyinin kurulumu ve yürütülmesinde size rehberlik edeceğiz. Ayrıca basit veri analizi iş akışını da özetliriz.
Bu tekniğin avantajı basit ve sağlam olmasıdır. Bir molekül iki boncuk arasında bağlanır, lazer ışınlarının odağına bağlanır ve yer değiştirme üzerine değişim ve kuvvet, kuvvet rampası deneylerinde tam olarak ölçülebilir. Bir bağın içindeki ikincil yapılar, molekülün iç enerjiye bağlı olarak belirli bir kuvvette ortaya çıkıyor.
Birden fazla yapı arasındaki bu dinamik geçiş, sabit kuvvet ölçümleri ile daha fazla araştırılabilir. Ayrıca, floresan görüntülemenin paralel kullanımı, bağlama olaylarını gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için kullanılabilir. Bir bağın belirgin bir kuvvet mesafesi profili, stabilitesini etkileyen potansiyel işlem faktörlerinin bağlanmasından sonra değişebilir.
İlk olarak, ilgi çekici RNA bir DNA vektörüne klonlandırılmalıdır. Bu dizinin yukarı ve aşağı akışı, boncuklar arasında son DNA-RNA yapısını bağlamak için ek parçalar, tutamaklar gereklidir. Plazmidde başarılı klonlama ve amplifikasyondan sonra üç farklı PCR reaksiyonu gerçekleştirilir.
Her PCR reaksiyon için, reaktifleri protokoldeki tablo bire göre karıştırın. PCR'ı uygun bir termal çevrimde 50 mikroliter aliquots'ta çalıştırın. İlki, sonraki in-vitro transkripsiyon için T7 promotörü ile tüm yapının çift iplikli DNA'sı ile sonuçlanır.
İkinci PCR beş asal tutamak üretir. Oysa son reaksiyon üç asal tutamakla sonuçlanır. Kullanılan boncuklara göre hem 5 asal hem de 3 asal tutamak etiketlendirilmelidir.
Üç asal tutamak PCR sırasında ters astar etiketli bir digoksitin kullanılarak etiketlenir ve beş asal tutamak biyotinilasyon yoluyla ekstra bir adımda etiket edilmelidir. Beş asal sapın üç asal biyotinilasyonu T 40 ve bir polimeraz kullanılarak gerçekleştirilir. Reaksiyon oda sıcaklığında bir ila iki saat boyunca gerçekleştirilir.
Daha sonra, T7 polimeraz kullanarak in-vitro transkripsiyonu gerçekleştirin. RNA'nın uzunluğuna bağlı olarak reaksiyonun 37 derecesini iki ila dört saat boyunca kuluçkaya yatırın. Son bir adımda, tutamaklar, çift iplikli tutamaklar arasındaki tek iplikli ilgi alanı ile son DNA-RNA yapısını elde etmek için in-vitro transkripsiyondan RNA ile tavlanır.
İstenilen RNA-DNA melezini tavlamak için sapları ve RNA'yı tavlama tamponunda karıştırın. Isı, tavlama karışımı 10 dakika boyunca 85 dereceye kadar ve ardından numuneyi yavaşça dört dereceye kadar soğutun. Tavlanmış numuneyi üç azı dişi sodyum asetat hacminin 1/10'u ve üç hacimli buz soğuk etanol ile karıştırın ve en az bir saat boyunca eksi 80 derece kuluçkaya yatırın.
Numuneleri 15.000 xg'de 30 dakika boyunca dört derecede santrifüj edin. Süpernatant atın ve peletin vakum altında kurutun. Yeniden kullanılan peletlerin küçük aliquotları sıvı nitrojen içinde dondurulur ve kullanılana kadar eksi 80 derecede tutulur.
İlk önce çamaşır suyunu şırınnalardan çıkarın ve bir mL RNase içermeyen su doldurun. 50 mikroliter 0,5 molar sodyum tiyosülfat ekleyin ve sistemi tek çubukla yıkayın. Sistemdeki hava kabarcıklarını önlemek için mikroakışkan sistemin asla kuru olmadığına dikkat edin.
Daha sonra, kalan sodyum tiyosülfat çözeltisini atın ve şırıngları yenileriyle değiştirin. Daha sonra en az 0,5 mL RNase içermeyen su ile tekrar yıkayın. Makinenin optik sistemini kurmak için hedefe iki damla daldırma yağı koyun.
Akış hücresini yerine yerleştirin ve sıvı akış hücresine dokunana kadar hedefi yükseltin. Daha sonra akış hücresinin üzerine iki damla daldırma yağı koyun. Şimdi tuzak direksiyon ünitesini ve bindirme lazerini açın.
Amaç, makinenin tanı kameralarının Z bulucu aracı kullanılarak ayarlanır. Mikro vida döndürülerek, Z ekseni ikinci ve üçüncü yansıma arasındaki odanın ortasına ayarlanır. Kırılma halkalarının en büyük olduğu yer.
Tanı kameralarını ay moduna geçirin ve bindirme lazerini yaklaşık% 50'ye düşürün, ardından kondenseri 20'ye düşürün ve konumunu yaklaşık 10 ışık bandı görecek şekilde ayarlayın. Ölçüm odasının beş kanalı vardır ve deneyden önce farklı kurulum olanakları göz önünde bulundurulmalıdır. Basit bir kuvvet rampası deneyi için boncuk-tampon boncukları uygun bir kanal düzenlemesidir.
Floresan ribozomlar veya işlem faktörleri gibi dördüncü bileşikle yapılan ölçümler için boncuk-boncuk tampon faktörü daha iyi bir düzenlemedir, ancak boncuk yakalamayı zorlaştırır. Tavlanmış yapının bir aliquot'ı üç mikroliter AD boncuk süspansiyonu, bir mikroliter RNaz inhibitörü ve 10 ila 20 dakika boyunca oda sıcaklığında test tamponunun sekiz mikroliteri ile inkübe edilir. Daha sonra numune 500 mikroliter test tamponunda seyreltilir ve ilgili kanala konur.
İkinci tür boncuklar için, 0,8 mikroliter tahlil boncukları bir mL tahlil tamponu ile karıştırılır ve ilgili kanala uygulanır. Kanallar açılır ve düşük basınçla yıkanır. Şimdi bindirme lazerini aç.
Boncukları yakalamak için lazerler birbirinden ayrılır ve bir AD boncuk tuzak bire yakalanır. Daha sonra sahne SA boncuk kanalına taşınır ve bir boncuk ikinci tuzağa yakalanar. Boncukları kaybetmemek veya aynı tuzakta ikincisini yakalamak için aşama arabellek kanalına taşınır ve tüm kanallar kapatılır.
Tamponda, bir bindirme kalibrasyonu gerçekleştirilir. Yakalanan boncuklar sonraki ölçümler için görsel şablonlar olarak ayarlanmalıdır. Ve benzerlik puanı, karşılaştırılabilmeyi garanti etmek için ölçümler arasında% 90'ın üzerinde tutulmalıdır.
Son olarak, boncuklar birbirine yakınlaştırılır ve tek bir bağ yakalamaya başlayabilir. Bu, boncukları birkaç saniyeliğine yakın bir şekilde hareket ettirerek ve ardından boncukları yavaşça tekrar terk ederek yapılır. Bir bağ oluşumu, iki boncuk birbirinden uzaklaştıktan sonra ölçülen kuvvetin artmasına neden olur.
Bağlamaların sayısı ve kalitesi, aşırı uzanma platosu bulunarak kontrol edilebilir ve yörüngeyi serbestçe birleşmiş zincir veya solucan benzeri zincir modeli ile karşılaştırabilir. Geniş plato, tek bir bağ için 50 ila 60 piconewton arasında olmalıdır. Floresan ölçümlerini gerçekleştirmek için konfokal lazerleri açın ve ünite ve optik cımbız makinesinde foton sayımını açın.
Daha sonra, istenen dalga boyunun ve yazılım arayüzünün uyarlama lazerini açın ve florofora bağlı olarak lazerin gücünü% 5 veya daha yüksek olarak ayarlayın. Artık yazılımın görüntü veya kimograf fonksiyonları kullanılarak görüntüleme başlatılabilir. İyi odaklanmış görüntüler elde etmek için, konfokal mikroskop ve optik tuzakların odak düzleminin hizalı olduğundan emin olun.
Bu amaçla mavi lazer kanalındaki polistiren boncukların otoflüoresansı kullanılabilir. Boncukların otofluoresansı en yüksek çapa ulaşana kadar optik tuzakların odak düzlemi ile yukarı ve aşağı hareket edin. Bu pozisyonda, bağlı molekülde gerçekleşen floresan sinyalleri tespit edilebilir.
Her iki işlev için de uygun ilgi alanlarını seçmek önemlidir. Ölçüm boyunca tampon bileşimi, boncukların farklı kanallara taşınması veya mikroakışkan sistemde sağlanan tamponun değiştirilmesiyle kolayca değiştirilebilir. Fotobleaching önlemek için, ölçüm değilken her zaman excitation lazer kapatın.
Cihazdan gelen ham veri çıkışı genellikle çok fazla gürültü içerir. Bu nedenle, dağınık verileri daha fazla analiz etmek için, önce bunları önceden işlemek gerekir. İlk adım, numuneyi aşağı çekmek ve verileri düşük geçişli Butterworth filtresiyle filtrelemektir, iyi sonuçlar elde edilmiştir.
Kuvvet rampası deneyleri için, açılan olayların ilk mesafe eğrisinin ilgili katlanmış ve açılmamış bölgelerinde işaretlenmiş olması gerekir solucan benzeri zincir veya serbestçe eklemlenmiş zincir modelleri kullanılarak takılabilir. Sabit kuvvet verileri için, zaman üzerindeki mesafe çizilebilir ve belirli bir kuvvetteki baskın uygunluğu ölçmek için bir histogram oluşturmak yararlıdır. Burada, filtre parametrelerinin farklı katlama durumlarını ayırt etmek için çok önemli olduğu gösterilmiştir.
Bu teknikle neler başarılabilir daha iyi anlamak için bazı temsili sonuçlar gösterilmiştir. Bir kuvvet rampası deneyinden standart bir kuvvet mesafesi eğrisi böyle görünür. Bu durumda SARS-coronavirus-2 kare değiştirme elemanını inceledik.
15 piconewton civarında birden fazla adımda açılma gözlemledik. Yön tersine çevrildiğinde ve boncuklar tekrar yaklaştığında, bağ biraz daha düşük kuvvette geri katlanır. Çinko parmak antiviral protein ZAP varlığında aynı RNA'yı ölçtürürken, benzer bir açılma patörü gözlendi.
Ancak RNA'nın ikincil yapısı yeniden kata çıkmadı. Bu, protein bağlamanın RNA kinetiği üzerinde ne kadar büyük bir etkisi olabileceğini göstermek için iyi bir örnektir. Sürekli kuvvet verilerine bakıldığında, ortaya çıkan kinetikler daha fazla araştırılabilir.
Zaman içinde mesafe farklı kuvvetler için çizilir ve sağda farklı gözlemlenen durumların histogramı eklenir. 10 piconewton'da, RNA tamamen katlanmış durumdadır. 11.5 piconewton'da eyaletler arasında geçiş yapılır ve 13 piconewton'da RNA kalıcı olarak açılmamış bir durumdadır.
Bununla birlikte, SARS-coronavirus-2 kare kaydırma elemanı ZAP ile birlikte ölçüldüğünde, RNA 11 piconewton'da tamamen açılmış durumdaydı ve hatta 10 piconewton'da katlanmış bir duruma doğru çok az geçiş gösterdi. Bu, ZAP'ın tek bir iplikli çerçeve kaydırma elemanına bağlandığını ve ikincil bir yapının oluşumunu engellediğini gösterir. Son olarak, konfokal mikroskopi ile birleştirilmiş bazı optik cımbız verilerine bakacağız.
Bu deneyde, çift iplikli nükleik asitleri etiketleyen bir floresan boya kullanıldı, özellikle artan kuvvetle değil. Kimograf, boncuklar birbirinden uzaklaştıkça floresan yoğunluğunun arttığını ve bağ çok fazla gerildikten ve koptuğunda tamamen kaybolduğunu göstermektedir. Son rakamda floresan etiketli ribozomlar kanal 4'e eklendi.
Bu deneyde RNA bağına özgü ribozom bağlanması gözlenmiştir. Umarız bu video size optik cımbızlar ve bu inanılmaz tekniğin neler yapabileceği hakkında bir fikir vermiştir.
