Общей целью следующей статьи о методе является демонстрация протокола, полезного для изучения взаимодействий РНК с белками или другими факторами с использованием оптического пинцета в сочетании с конфокальной микроскопией. За последнее десятилетие было разработано несколько сложных методов для исследования свойств отдельных макромолекул. Одним из таких методов является одномолекулярный оптический пинцет.
С помощью нового флуоресцентного оптического пинцета можно детально контролировать не только силы, необходимые для разворачивания молекул РНК, но и события связывания во время трансляции. Здесь мы сосредоточимся на измерениях, в которых молекулы РНК растягиваются с помощью и без трансакционных факторов, которые регулируют трансляцию. Мы также иллюстрируем, как этот метод может быть применен для мониторинга перевода с использованием меченых рибосом.
Протокол продемонстрируют два аспиранта в моей группе, Лукас Пекарек и Стефан Парк. В этом видео мы проведем вас через настройку и выполнение эксперимента с оптическим пинцетом. Мы также описываем простой рабочий процесс анализа данных.
Преимущество этой техники заключается в том, что она проста и надежна. Молекула привязана между двумя шариками, привязанными к фокусу лазерных лучей, и изменение и сила при смещении могут быть точно измерены в так называемых экспериментах с силовой рампой. Вторичные структуры внутри троса разворачиваются с определенной силой в зависимости от внутренней энергии молекулы.
Этот динамический переход между несколькими структурами может быть дополнительно исследован с помощью измерений постоянной силы. Кроме того, параллельное использование флуоресцентной визуализации может быть использовано для визуализации событий связывания в режиме реального времени. Четкий профиль силы-расстояния троса может изменяться после связывания потенциальных факторов транзакции, влияющих на его стабильность.
Во-первых, интересующая РНК должна быть клонирована в вектор ДНК. Вверх и вниз по течению этой последовательности необходимы дополнительные части, ручки, чтобы связать конечную конструкцию ДНК-РНК между бусинами. После успешного клонирования и амплификации плазмиды проводят три различные реакции ПЦР.
Для каждой реакции ПЦР смешайте реагенты в соответствии с первой таблицей в протоколе. Запустите ПЦР в 50 микролитровых аликвотах в соответствующем тепловом циклоре. Первый приводит к двухцепочечной ДНК всей конструкции с промотором Т7 для последующей транскрипции in vitro.
Вторая ПЦР производит пять первичных ручек. В то время как последняя реакция приводит к трем основным ручкам. Как 5 основных, так и 3 основные ручки должны быть маркированы в соответствии с используемыми бусинами.
Три основные ручки маркируются во время ПЦР с помощью дигоксигениновой меткой обратной грунтовки, а пять первичных ручек должны быть помечены на дополнительном этапе через биотинилирование. Три первичных биотинилирования пяти первичных ручек выполняют с использованием T40 и полимеразы. Реакцию проводят в течение одного-двух часов при комнатной температуре.
Далее проводят транскрипцию in vitro с использованием Т7-полимеразы. Инкубируют реакцию при 37 градусах в течение двух-четырех часов, в зависимости от длины РНК. На последнем этапе ручки отжигаются рНК из транскрипции in vitro для получения окончательной конструкции ДНК-РНК с одноцепочечной областью интереса между двухцепочечными ручками.
Чтобы отжечь желаемый гибрид РНК-ДНК, смешайте ручки и РНК в буфере отжига. Нагревают, отжигают смесь до 85 градусов в течение 10 минут, а затем медленно охлаждают образец до четырех градусов. Смешайте отожженный образец с 1/10 объема трех молярных ацетатов натрия и тремя объемами ледяного холодного этанола и инкубата минус 80 градусов в течение не менее часа.
Центрифугируйте образцы при 15 000 хг в течение 30 минут при четырех градусах. Выбросьте супернатант и высушите гранулы под вакуумом. Небольшие аликвоты повторно суспендированных гранул замораживают в жидком азоте и выдерживают при минус 80 градусах до тех пор, пока они не будут использованы.
Сначала удалите отбеливатель из шприцев и заполните один мл воды без РНКазы. Добавьте 50 микролитров 0,5 молярного тиосульфата натрия и промойте систему одним баром. Будьте осторожны, чтобы микрофлюидная система никогда не пересыхала, чтобы избежать пузырьков воздуха в системе.
Далее выбрасывают оставшийся раствор тиосульфата натрия и заменяют шприцы новыми. Затем снова промыть не менее 0,5 мл воды, свободной от РНКазы. Чтобы настроить оптическую систему машины, нанесите на объектив две капли погружного масла.
Поставьте проточную ячейку на место и поднимите объектив до тех пор, пока жидкость не коснется проточной ячейки. Затем нанесите две капли погружного масла поверх проточной ячейки. Теперь включите рулевой блок ловушки и улавливающий лазер.
Цель регулируется с помощью инструмента Z finder диагностических камер машины. Поворачивая микровинт, ось Z регулируется к середине камеры между вторым и третьим отражением. Где кольца преломления самые большие.
Переключите диагностические камеры в лунный режим и уменьшите улавливающий лазер примерно до 50%, затем опустите конденсатор и отрегулируйте его положение, чтобы вы видели примерно 10 световых полос. Измерительная камера имеет пять каналов, и перед экспериментом следует рассмотреть различные возможности настройки. Для простого эксперимента с силовой рампой бусины-буфер-бусины - это удобное расположение каналов.
Для измерений с четвертым соединением, таким как флуоресцентные рибосомы или трансакционные факторы, фактор бисера-бусины-буфер является лучшим расположением, но он затрудняет ловлю бусин. Аликвота отожженной конструкции инкубируется с тремя микролитрами суспензии БУСИН AD, одним микролитром ингибиторов РНКазы и восемью микролитрами буфера анализа при комнатной температуре в течение 10-20 минут. Затем образец разбавляют в 500-микролитровом буфере анализа и помещают в соответствующий канал.
Для второго вида бусин 0,8 микролитра пробирных шариков смешивают с одним мл буфера анализа и вводят в соответствующий канал. Каналы открываются и промываются при низком давлении. Теперь включите улавливающий лазер.
Чтобы поймать бусины, лазеры перемещаются отдельно друг от друга, и бусина AD попадает в ловушку. Далее ступень перемещается в канал SA, и бусина попадает в ловушку две. Чтобы не потерять бусины, или поймать вторую в ту же ловушку, ступень перемещается в буферный канал и все каналы закрываются.
В буфере выполняется калибровка ловушки. Пойманные бусины должны быть установлены в качестве визуальных шаблонов для последующих измерений. И показатель сходства должен поддерживаться выше 90% между измерениями, чтобы гарантировать сопоставимость.
Наконец, бусины сдвигаются ближе друг к другу, и можно начать ловить один трос. Это делается, перемещая бусины вблизи на несколько секунд, а затем медленно отклоняясь от бусин снова. Образование троса приводит к увеличению измеренной силы при оттягивании двух бусин друг от друга.
Количество и качество тросов можно проверить, найдя растянутое плато и сравнив траекторию со свободно сцепленной цепной или червеобразной моделью цепи. Растянутое плато должно составлять от 50 до 60 пиконьютонов для одного троса. Для выполнения флуоресцентных измерений включите конфокальные лазеры и подсчитайте фотоны на аппарате и аппарате оптического пинцета.
После этого включите лазер возбуждения нужной длины волны и программный интерфейс и установите мощность лазера на 5% или выше, в зависимости от флуорофора. Теперь визуализацию можно начать с помощью функций изображения или кимографа программного обеспечения. Чтобы получить хорошо сфокусированные изображения, убедитесь, что фокальная плоскость конфокального микроскопа и оптические ловушки выровнены.
Для этого может быть использована автофлуоресценция полистирольных шариков в синем лазерном канале. Двигайтесь вверх и вниз с фокальной плоскостью оптических ловушек до тех пор, пока автофлуоресценция бусин не достигнет своего наибольшего диаметра. В этом положении могут быть обнаружены флуоресцентные сигналы, происходящие на привязанной молекуле.
Для обеих функций важно выбрать соответствующие интересующие регионы. На протяжении всего измерения состав буфера может быть легко изменен либо путем перемещения шариков в разные каналы, либо путем изменения буфера, подаваемого в микрофлюидную систему. Чтобы избежать фотоотбеливания, всегда выключайте лазер возбуждения, когда его не измеряют.
Необработанные данные, выводимые с устройства, часто содержат много шума. Поэтому, чтобы в дальнейшем проанализировать разрозненные данные, нужно сначала предварительно их обработать. Первым шагом является понижение образца и фильтрация данных с помощью низкочастотного фильтра Баттерворта, были получены хорошие результаты.
Для экспериментов с силовой рампой разворачивающиеся события должны быть отмечены в соответствующих сложенных и развернутых областях первой кривой расстояния, которые могут быть установлены с использованием червеобразных цепных или свободно соединенных цепных моделей. Для данных о постоянной силе расстояние во времени может быть построено, и полезно создать гистограмму для количественной оценки преобладающей конформации при заданной силе. Здесь показано, что параметры фильтра имеют решающее значение для различения различных состояний складывания.
Для лучшего понимания того, чего можно достичь с помощью этой техники, показаны некоторые репрезентативные результаты. Вот как выглядит стандартная кривая силы-расстояния из эксперимента с рампой силы. В данном случае мы изучили элемент сдвига кадров SARS-coronavirus-2.
Мы наблюдали, как разворачивается в несколько шагов около 15 пиконьютонов. Когда направление меняется на противоположное и бусины снова приближаются, трос откидывается назад с немного меньшей силой. Когда мы измерили ту же РНК в присутствии противовирусного белка ЦИНКОВОГО ПАЛЬЦА ZAP, наблюдалась аналогичная картина развертывания.
Но вторичная структура РНК не переворачивалась. Это хороший пример, чтобы показать, какое большое влияние связывание белка может оказать на кинетику РНК. Глядя на данные о постоянной силе, кинетика разворачивания может быть дополнительно исследована.
Расстояние во времени строится для разных сил, а справа добавляется гистограмма различных наблюдаемых состояний. При 10 пиконьютоне РНК полностью находится в сложенном состоянии. При 11,5 пиконьютоне она переключается между состояниями, а в 13 пиконьютон РНК постоянно находится в развернутом состоянии.
Однако, когда элемент сдвига кадра SARS-coronavirus-2 был измерен вместе с ZAP, РНК была полностью в развернутом состоянии в 11 пиконьютон и даже показала очень небольшой переход к сложенному состоянию при 10 пиконьютоне. Это указывает на то, что ZAP связывается с одноцепочечным сдвигающим элементом рамы и предотвращает образование вторичной структуры. Наконец, мы рассмотрим некоторые данные оптического пинцета в сочетании с конфокальной микроскопией.
В этом эксперименте был использован флуоресцентный краситель, который маркирует двухцепочечные нуклеиновые кислоты, не особенно с увеличивающейся силой. Кимограф показывает, что по мере того, как бусины раздвигаются друг от друга, интенсивность флуоресценции увеличивается, и она полностью исчезает, как только трос слишком сильно растягивается и ломается. На последнем рисунке флуоресцентно меченые рибосомы добавляли через четвертый канал.
В этом эксперименте наблюдалось специфическое связывание рибосом с тросом РНК. Мы надеемся, что это видео дало вам представление об оптическом пинцете и о том, что можно выполнить этой невероятной техникой.
