التعرض للإجهاد يمكن أن يسبب تراكم البروتين ويؤدي إلى تغييرات كبيرة في السلوك الظاهري للبكتيريا. الإجراء الموصوف في هذا الفيديو يسمح باستخراج وتصور مجاميع البروتين بعد علاج الإجهاد. وعلى النقيض من الإجراءات المنشورة الأخرى، يتطلب هذا البروتوكول انخفاض أعداد الخلايا ويمتنع عن عمليات التعطيل البدني المعقدة، فضلا عن خطوات الغسيل والحضانة التي تستغرق وقتا طويلا.
يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة تجميع البروتين في مجموعة واسعة من البكتيريا السلبية والجرام إيجابية. يمكنك أيضا تحليل تأثير حذف الجينات أو مقارنة فعالية المركبات البروتيوتوكسية. تبدأ عن طريق تلقيح مستعمرة واحدة من سلالة E.coli MG1655 وuropathogenic E.coli سلالة CFT073، كل في خمسة ملليلتر من مرق الليوجيني، أو LB، المتوسطة.
احتضان ثقافتي المرق عند 37 درجة مئوية و 300 دورة في الدقيقة لمدة 14 إلى 16 ساعة. تمييع كل سلالة إلى كثافة بصرية في 600 نانومتر، أو OD600، من 0.1 في قارورة 500 ملليلتر تحتوي على 70 ملليلتر من المتوسط MOPS-g. احتضان القوارير في 37 درجة و 300 دورة في الدقيقة حتى يتم الوصول إلى مرحلة منتصف السجل.
بعد الحضانة، قم بنقل 20 ملليلتر من كل ثقافة إلى ثلاث قوارير 125 ملليلتر مسبقة الدفء، واحتضانها عند 37 درجة مئوية و300 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين. إعداد محلول مركب مضاد للميكروبات مليغرامين لكل ملليلتر في المتوسط MOPS-g. أضف هذا الحل إلى كل ثقافة للوصول إلى التركيزات المطلوبة، وإضافة الحجم المطلوب من MOPS-g المتوسط للتحكم غير المعالج.
تحديد OD600 من كل ثقافة بعد 45 دقيقة من علاج الإجهاد. لكل عينة، aliquot أربعة ملليلتر من الثقافة مع OD600 من واحد إلى أنابيب الطرد المركزي 15 ملليلتر. Resuspend الكريات الخلية في 50 ميكرولتر من الجليد الباردة تحلل العازلة.
احتضان العينات لمدة 30 دقيقة على الجليد. إضافة 360 ميكرولتر من الجليد الباردة العازلة ألف إلى العينات، وتخلط بلطف عن طريق pipetting. نقل العينات إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيق مليلترين مع حوالي 200 ميكرولتر من الخرز الزجاجي 0.5 ملليمتر.
احتضان الأنابيب لمدة 30 دقيقة في ثماني درجات مئوية في ThermoMixer مع اهتزاز في 1400 دورة في الدقيقة. احتضان الأنابيب على الجليد لمدة خمس دقائق دون اهتزاز لتسوية الخرز الزجاجي. ثم نقل 200 ميكرولتر من lysate الخلية في أنابيب الطرد المركزي الدقيق 1.7 ملليلتر.
الطرد المركزي الخلية lysate لمدة 20 دقيقة في 16، 000 مرة ز وأربع درجات مئوية. جمع supernatant، والتي سوف تستخدم كعينة البروتين القابل للذوبان في وقت لاحق. استخدام ماصة لإعادة إنفاق بيليه في 200 ميكرولتر من الجليد الباردة العازلة A.Centrifuge من الأنابيب في 16، 000 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
ثم إزالة بعناية فائقة تماما. استخدام ماصة لإعادة إنفاق بعناية بيليه في 200 ميكرولتر من الجليد الباردة العازلة B.Centrifuge الأنابيب مرة أخرى، وإزالة بعناية supernatant. ثم كرر الغسيل مع العازلة A.Resuspend بيليه في 100 ميكرولتر من 1x الحد من المخزن المؤقت عينة SDS، ويغلي لمدة خمس دقائق في ThermoMixer في 95 درجة مئوية.
مزيج حجم واحد من 100٪ TCA مع أربعة أحجام من عينة البروتين القابل للذوبان التي تم جمعها في وقت سابق، واحتضان لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية لهطول الأمطار البروتين. الطرد المركزي العينة في 21، 000 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق للحصول على عجل، وإزالة supernatant. استخدام 200 ميكرولتر من الأسيتون الجليد الباردة لغسل بيليه، لإزالة الحطام الخلوي.
الطرد المركزي العينة مرة أخرى للحصول على عجل، وإزالة supernatant. لإزالة الأسيتون المتبقي من الكريات، احتفظ بأنابيب الطرد المركزي الدقيق في ThermoMixer عند 37 درجة مئوية مع فتح جفونها. ثم أضف 100 ميكرولتر من 1x الحد من العازلة SDS لإذابة بيليه تماما، وغلي العينة في 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.
قم بتحميل العينة على الفور على هلام بولي أكريلاميد SDS للفصل ، أو قم بتخزين العينة عند ناقص 20 درجة مئوية للمضي قدما لاحقا. إعداد اثنين من المواد الهلامية فصل كما هو موضح في المخطوطة النصية. صب الجل بين لوحات الزجاج باستخدام ماصة ملليلتر واحد، وضمان أن العلوي سنتيمترين خالية من الخليط.
إضافة 70٪ الإيثانول على رأس هلام فصل، وخلق واجهة حتى بين الطبقتين. بمجرد أن يبوليمر المواد الهلامية الفاصلة ، قم بإعداد المواد الهلامية المكدسة باستخدام التعليمات الواردة في المخطوطة النصية. ثم إزالة الإيثانول من المواد الهلامية فصل، وإضافة محلول هلام التراص.
أدخل بعناية مشط مع العدد المطلوب من الجيوب دون إدخال فقاعات الهواء، والسماح للهلام لبوليمرة لمدة 20 إلى 30 دقيقة. تحميل أربعة ميكرولترات من كل عينة، فضلا عن سلم البروتين، في آبار منفصلة. ثم تشغيل هلام في تريس الجليسين تشغيل العازلة في 144 فولت لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
استخدام حل فيربانكس قبل الحارة ألف للطخة المواد الهلامية على الروك لمدة 30 دقيقة وقبل الحارة فيربانكس حل D لإلغاء لون المواد الهلامية على الروك حتى يتم تحقيق الخلفية المطلوبة. ولوحظت زيادة في كمية البروتين المجمعة التي تشكلت عندما عولجت الخلايا ب 175 ميكروغراما لكل ملليلتر و 200 ميكروغرام لكل ملليلتر من مضادات الميكروبات، مقارنة بالخلايا غير المعالجة. كانت الزيادة في كسر البروتين غير القابل للذوبان أكثر وضوحا في سلالة MG1655 الأكثر حساسية.
ولوحظ انخفاض في كمية البروتينات القابلة للذوبان عندما عولجت الخلايا ب 175 ميكروغراما لكل ملليلتر و 200 ميكروغرام لكل ملليلتر من مضادات الميكروبات، مقارنة بالخلايا غير المعالجة. عند محاولة هذا البروتوكول، ضع في اعتبارك أن تطبيع الكثافة البصرية عند 600 نانومتر مهم لمقارنة مدى تجميع البروتين في العينات.
