Die Exposition gegenüber Stress kann zu einer Proteinaggregation führen und zu signifikanten Veränderungen im phänotypischen Verhalten von Bakterien führen. Das in diesem Video beschriebene Verfahren ermöglicht die Extraktion und Visualisierung von Proteinaggregaten nach der Stressbehandlung. Im Gegensatz zu anderen veröffentlichten Verfahren erfordert dieses Protokoll geringere Zellzahlen und verzichtet auf komplizierte physikalische Störungsprozesse sowie zeitaufwändige Wasch- und Inkubationsschritte.
Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Proteinaggregation in einer Vielzahl von gramnegativen und grampositiven Bakterien zu untersuchen. Sie können auch die Wirkung von Genstreichungen analysieren oder die Wirksamkeit proteotoxischer Verbindungen vergleichen. Beginnen Sie mit der Impfung einer einzelnen Kolonie des E.coli-Stammes MG1655 und des uropathogenen E.coli-Stammes CFT073 in jeweils fünf Milliliter Lysogenbrühe oder LB-Medium.
Inkubieren Sie die beiden Brühenkulturen bei 37 Grad Celsius und 300 U/ min für 14 bis 16 Stunden. Verdünnen Sie jeden Stamm auf eine optische Dichte von 600 Nanometern oder OD600 von 0,1 in einen 500-Milliliter-Kolben mit 70 Millilitern MOPS-g-Medium. Inkubieren Sie die Kolben bei 37 Grad und 300 U / min, bis die mittlere Log-Phase erreicht ist.
Nach der Inkubation 20 Milliliter jeder Kultur in drei vorgewärmte 125-Milliliter-Kolben geben und bei 37 Grad Celsius und 300 U/ min für zwei Minuten inkubieren. Bereiten Sie eine antimikrobielle Verbindungslösung mit zwei Milligramm pro Milliliter in MOPS-g-Medium vor. Fügen Sie diese Lösung zu jeder Kultur hinzu, um die gewünschten Konzentrationen zu erreichen, und fügen Sie das erforderliche Volumen an MOPS-g-Medium für die unbehandelte Kontrolle hinzu.
Bestimmen Sie den OD600 jeder Kultur nach 45 Minuten Stressbehandlung. Aliquotieren Sie für jede Probe vier Milliliter Kultur mit einem OD600 von einem in 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Resuspend die Zellpellets in 50 Mikroliter eiskaltem Lysepuffer.
Inkubieren Sie die Proben für 30 Minuten auf Eis. Fügen Sie den Proben 360 Mikroliter eiskalten Puffer A hinzu und mischen Sie sie vorsichtig durch Pipettieren. Die Proben werden in zwei Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit rund 200 Mikrolitern 0,5-Millimeter-Glasperlen überführen.
Inkubieren Sie die Röhrchen 30 Minuten lang bei acht Grad Celsius in einem ThermoMixer mit Schütteln bei 1400 U/min. Inkubieren Sie die Schläuche fünf Minuten lang auf Eis, ohne zu schütteln, um die Glasperlen abzulegen. Anschließend werden 200 Mikroliter des Zelllysats in 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen.
Zentrifugieren Sie das Zelllysat für 20 Minuten bei 16.000 mal g und vier Grad Celsius. Sammeln Sie den Überstand, der später als lösliche Proteinprobe verwendet wird. Verwenden Sie eine Pipette, um das Pellet in 200 Mikrolitern eiskaltem Puffer A.Zentrifuge der Röhrchen bei 16.000 mal g und vier Grad Celsius für 20 Minuten wieder aufzubewältigen.
Entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand ganz. Verwenden Sie eine Pipette, um das Pellet vorsichtig in 200 Mikroliter eiskaltem Puffer B wieder aufzubelaufen.Zentrifugieren Sie die Röhrchen erneut und entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Dann wiederholen Sie die Wäsche mit Puffer A.Resuspend das Pellet in 100 Mikrolitern 1x reduzierendem SDS-Probenpuffer und kochen Sie es fünf Minuten lang in einem ThermoMixer bei 95 Grad Celsius.
Mischen Sie ein Volumen von 100% TCA mit vier Volumina der zuvor gesammelten löslichen Proteinprobe und inkubieren Sie sie für 10 Minuten bei vier Grad Celsius für die Proteinfällung. Zentrifugieren Sie die Probe bei 21.000 mal g und vier Grad Celsius für fünf Minuten, um den Niederschlag zu erhalten, und entfernen Sie den Überstand. Verwenden Sie 200 Mikroliter eiskaltes Aceton, um das Pellet zu waschen und Zellablagerungen zu entfernen.
Zentrifugieren Sie die Probe erneut, um den Niederschlag zu erhalten, und entfernen Sie den Überstand. Um das restliche Aceton aus den Pellets zu entfernen, halten Sie die Mikrozentrifugenröhrchen im ThermoMixer bei geöffneten Deckeln bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie dann 100 Mikroliter mit 1x reduzierendem SDS-Puffer hinzu, um das Pellet vollständig aufzulösen, und kochen Sie die Probe bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten.
Laden Sie die Probe sofort zur Trennung auf ein SDS-Polyacrylamidgel oder lagern Sie die Probe bei minus 20 Grad Celsius, um später fortzufahren. Bereiten Sie zwei Trenngele vor, wie im Textmanuskript beschrieben. Gießen Sie das Gel mit einer Ein-Milliliter-Pipette zwischen die Glasplatten und stellen Sie sicher, dass die oberen zwei Zentimeter frei von der Mischung sind.
Fügen Sie 70% Ethanol auf das Trenngel hinzu, wodurch eine gleichmäßige Grenzfläche zwischen den beiden Schichten entsteht. Sobald die Trenngele polymerisiert sind, bereiten Sie die Stapelgele anhand der Anweisungen im Textmanuskript vor. Dann entfernen Sie das Ethanol aus den Trenngelen und fügen Sie die Stapelgellösung hinzu.
Führen Sie vorsichtig einen Kamm mit der gewünschten Anzahl von Taschen ein, ohne Luftblasen einzuführen, und lassen Sie das Gel 20 bis 30 Minuten polymerisieren. Laden Sie vier Mikroliter jeder Probe sowie die Proteinleiter in separate Vertiefungen. Dann lassen Sie das Gel in Tris-Glycin-Laufpuffer bei 144 Volt für 45 Minuten bei Raumtemperatur laufen.
Verwenden Sie vorgewärmte Fairbanks-Lösung A, um die Gele 30 Minuten lang auf einer Wippe zu färben, und vorgewärmte Fairbanks-Lösung D, um die Gele auf einer Wippe zu entfärben, bis der gewünschte Hintergrund erreicht ist. Es wurde ein Anstieg der Menge an Proteinaggregat beobachtet, die gebildet wurde, wenn Zellen mit 175 Mikrogramm pro Milliliter und 200 Mikrogramm pro Milliliter des antimikrobiellen Wirkstoffs behandelt wurden, verglichen mit unbehandelten Zellen. Der Anstieg der unlöslichen Proteinfraktion war im empfindlicheren MG1655-Stamm ausgeprägter.
Eine Abnahme der Menge an löslichen Proteinen wurde beobachtet, wenn Zellen mit 175 Mikrogramm pro Milliliter und 200 Mikrogramm pro Milliliter des antimikrobiellen Wirkstoffs im Vergleich zu unbehandelten Zellen behandelt wurden. Beachten Sie bei diesem Protokoll, dass die Normalisierung auf die optische Dichte bei 600 Nanometern für den Vergleich des Ausmaßes der Proteinaggregation in den Proben wichtig ist.
