L’exposition au stress peut provoquer une agrégation des protéines et entraîner des altérations significatives du comportement phénotypique des bactéries. La procédure décrite dans cette vidéo permet l’extraction et la visualisation d’agrégats de protéines après un traitement de stress. Contrairement à d’autres procédures publiées, ce protocole nécessite un nombre de cellules plus faible et s’abstient des processus de perturbation physique compliqués, ainsi que des étapes de lavage et d’incubation fastidieuses.
Ce protocole peut être utilisé pour étudier l’agrégation des protéines dans une grande variété de bactéries à Gram négatif et à Gram positif. Vous pouvez également analyser l’effet des délétions de gènes ou comparer l’efficacité des composés protéotoxiques. Commencez par inoculer une seule colonie de la souche MG1655 d’E. coli et de la souche uropathogène d’E. coli CFT073, chacune en cinq millilitres de bouillon de lysogénie, ou LB, milieu.
Incuber les deux cultures de bouillon à 37 degrés Celsius et 300 tr/min pendant 14 à 16 heures. Diluer chaque souche à une densité optique de 600 nanomètres, ou OD600, de 0,1 dans une fiole de 500 millilitres contenant 70 millilitres de milieu MOPS-g. Incuber les flacons à 37 degrés et 300 tr/min jusqu’à ce que la phase médiane soit atteinte.
Après l’incubation, transférer 20 millilitres de chaque culture dans trois flacons préchauffés de 125 millilitres et les incuber à 37 degrés Celsius et 300 tr/min pendant deux minutes. Préparer une solution de composé antimicrobien de deux milligrammes par millilitre dans un milieu MOPS-g. Ajouter cette solution à chaque culture pour atteindre les concentrations souhaitées, et ajouter le volume requis de milieu MOPS-g pour le témoin non traité.
Déterminer l’OD600 de chaque culture après 45 minutes de traitement du stress. Pour chaque échantillon, aliquote quatre millilitres de culture avec un OD600 d’un dans des tubes centrifuges de 15 millilitres. Resuspendez les pastilles cellulaires dans 50 microlitres de tampon de lyse glacée.
Incuber les échantillons pendant 30 minutes sur de la glace. Ajouter 360 microlitres de tampon A glacé aux échantillons et mélanger doucement par pipetage. Transférez les échantillons dans des tubes de microcentrifugation de deux millilitres avec environ 200 microlitres de billes de verre de 0,5 millimètre.
Incuber les tubes pendant 30 minutes à huit degrés Celsius dans un ThermoMixer en agitant à 1400 tr/min. Incuber les tubes sur de la glace pendant cinq minutes sans les secouer pour déposer les perles de verre. Transférez ensuite 200 microlitres du lysate cellulaire dans des tubes de microcentrifugation de 1,7 millilitre.
Centrifuger le lysate de la cellule pendant 20 minutes à 16 000 fois g et quatre degrés Celsius. Prélever le surnageant, qui sera utilisé comme échantillon de protéine soluble plus tard. Utilisez une pipette pour ressuspender la pastille dans 200 microlitres de tampon glacé A.Centrifugez les tubes à 16 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 20 minutes.
Ensuite, retirez soigneusement le surnageant complètement. Utilisez une pipette pour remettre soigneusement la pastille en 200 microlitres de tampon glacé B.Centrifugez à nouveau les tubes et retirez soigneusement le surnageant. Répétez ensuite le lavage avec le tampon A.Resuspendez la pastille dans 100 microlitres de 1x tampon d’échantillon SDS réducteur, et faites-la bouillir pendant cinq minutes dans un ThermoMixer à 95 degrés Celsius.
Mélanger un volume de 100% TCA avec quatre volumes de l’échantillon de protéine soluble prélevé plus tôt, et incuber pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius pour la précipitation des protéines. Centrifuger l’échantillon à 21 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes pour obtenir le précipité et retirer le surnageant. Utilisez 200 microlitres d’acétone glacée pour laver la pastille et éliminer les débris cellulaires.
Centrifugez à nouveau l’échantillon pour obtenir le précipité et retirez le surnageant. Pour éliminer l’acétone restante des granulés, maintenez les tubes de microcentrifugation dans le ThermoMixer à 37 degrés Celsius avec leurs couvercles ouverts. Ajoutez ensuite 100 microlitres de 1x tampon SDS réducteur pour dissoudre complètement la pastille, et faites bouillir l’échantillon à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes.
Chargez immédiatement l’échantillon sur un gel de polyacrylamide SDS pour la séparation, ou stockez l’échantillon à moins 20 degrés Celsius pour continuer plus tard. Préparez deux gels séparateurs comme décrit dans le manuscrit du texte. Versez le gel entre les plaques de verre à l’aide d’une pipette d’un millilitre, en veillant à ce que les deux centimètres supérieurs soient exempts du mélange.
Ajouter 70% d’éthanol sur le gel de séparation, créant une interface uniforme entre les deux couches. Une fois que les gels de séparation se sont polymérisés, préparez les gels empilables en utilisant les instructions du manuscrit textuel. Retirez ensuite l’éthanol des gels de séparation et ajoutez la solution de gel empilable.
Insérez soigneusement un peigne avec le nombre de poches souhaité sans introduire de bulles d’air et laissez le gel polymériser pendant 20 à 30 minutes. Chargez quatre microlitres de chaque échantillon, ainsi que l’échelle protéique, dans des puits séparés. Ensuite, faites fonctionner le gel dans un tampon de tris-glycine à 144 volts pendant 45 minutes à température ambiante.
Utilisez la solution Fairbanks A préchauffée pour tacher les gels sur une bascule pendant 30 minutes et la solution Fairbanks D préchauffée pour décolorer les gels sur une bascule jusqu’à ce que le fond souhaité soit atteint. Une augmentation a été observée dans la quantité d’agrégat protéique formé lorsque les cellules ont été traitées avec 175 microgrammes par millilitre et 200 microgrammes par millilitre de l’antimicrobien, par rapport aux cellules non traitées. L’augmentation de la fraction protéique insoluble était plus prononcée dans la souche MG1655 plus sensible.
Une diminution a été observée de la quantité de protéines solubles lorsque les cellules ont été traitées avec 175 microgrammes par millilitre et 200 microgrammes par millilitre de l’antimicrobien, par rapport aux cellules non traitées. Lorsque vous essayez ce protocole, gardez à l’esprit que la normalisation à la densité optique à 600 nanomètres est importante pour comparer l’étendue de l’agrégation des protéines dans les échantillons.
